Transcript Reversed Phase Column 선택 하는 법 3

Separation Basics
UHPLC_LC MSMS & Column Technology
Bene Technology Co., Ltd.
MKT
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내용
1. HPLC 의 역사
2. HPLC 의 구조, Terminology
3. 컬럼 의 분리 단, 구조
4. 분리모드
5. Reversed Phase Column선택하는 법
6. 분석방법 조정 가이드
Appendix
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1. HPLC 의 역사
1903
; Mikhail Tswett Separates Plant Pigments on Chalk Columns
1970년 이전 ; few reliable chromatographic methods
1970’년대
; open-column chromatography, paper chromatography, and thin-layer
chromatography => similar compounds
pressure liquid chromatography => flowthrough/purification times by column
chromatogaphy. Pump Technology (constant flow rate or constant pressure)
1970년대 중반 : High pressure liquid chromatography, column packing materials and
the on-line detectors => Performance
I970년대 후반 reverse phase liquid chromatography => very similar compounds.
1980년대 이후 ; 대부분의 chemical compounds 분리. New techniques=> Computers and
automation, typical column(250 mm L, 3-5 mm ID) => micro/capillary columns(1-2mm
ID, 3 µm-300 µm ID), affinity/chiral columns and Fast HPLC(Length 3-5mm, smaller
particles size10, 5, 3um), optimal analysis ; various types of columns, a variety of
detectors of the compound.
2000년대 ; GLP, UHPLC(Sub 2um), MSMS,… Quantitaton/Qualification,… Prep,…
응용영역 : biotechnological, biomedical, biochemical research, pharmaceutical industry,
cosmetics, energy, food, and environmental industries,…
2. HPLC 구조
Scale ?
Speed Separation
Sensitivity
Reproducibility
…
Conventional LC
Fluores.
Detector
LP Gradient
Pump
Manual/Auto
Injector
Column
UV/Vis
Detector
ELS
Detector
Pump
Mass Spec
HT LC : UPLC, RRLC, …
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HPLC Terminology
용매
LC/LCMS용
수용성 용매
지용성 용매
휘/비 Buffer
Filter
Degassing
=>펌프
Isocratic
HP/LP G
.
유속
압력
Run
Time
=>시료주입기 =>컬럼
수용성 용매
지용성 용매
Buffer
Filter
시료주입량
Injection
Start
=>검출기
->Data System
Separation
Chromatogram
Automation
Reversed P
Normal P
IE, SEC,…
Mixed
Chiral,…
Quan/Qual
Purity
Validation
IQ/OQ/PQ
Traceable
RI, UV/Vis
Fluo., PAD
ELSD,…
Preheat /cool
MS ; MRM/SRM
DDA,…
FTIR, NMR,…
유로(시스템/Tubing/컬럼)
; 내경, 길이, Void Volume, Equilibrium Time, Injection Volume,…
Teflon, SUS316, In-line filter, HDPE, Quarz,…
Nut Ferrule, Hand-tight fitting,…
* Compound Specific Information : m/z,…
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3. 컬럼의 분리 단
분배계수
KA = [A]u phase/[A]l phase
KA = [A]sol phase/[A]lliq phase
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Column의 구조의 활용
Tubing
Frit
분리관
Vt = Vo + Ve
Vt는
GPC/GFC의 경우 V의 약 75-80%
HPLC의 경우 V의 약 60-65%
안정화 부피 : Vt 의 10-20배 이상
시료 주입량 : Vt 의 0.5-10% 이하
시료 농도
: 시료 주입량의 0.I -10% 이하
충전물
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Column 충전물의 구조
Porous Beads
Totally Porous,
Non-Porous Beads
Superficially Porous,
Surface Porous
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Column 충전물의 Surface의 특징
Silica Surface(NPC)
Area m2/g
Chemistry
Si-OH’s
Bonding
RPC
Pore
Size
Chemistry
Particle
분포도
분자량
/Hydrodynamic Volume
Size
분포도
분리 능
• Silica는 일반적으로 pH 2-6.5 에서 사용하고 Bonding에 의해서 pH 1-11 까지 가능함
• pore size 60-120A은 4-10K 이하, 200-300A은 20-100K이하 분리함
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4. 분리모드 1 ; A, B, C term 이해
A. Eddy Diffusion
: 경로차
B. Longitudinal Diffusion
: 확산
C. Mass Transfer
: Pore Surface Interaction
Lateral Diffusion
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Van Deemter Plot
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분리모드 2 ; 그림으로 보는 분리
Steric Interaction
Adsorption Interaction: 컬럼 내/외 Surface
HPLC(RPC, NPC, IEX,..)
Adsorption(Energetic) Interaction
GPC/GFC
Steric(Entropic) Interaction
Injection
VE
VR
Vo
Log M
Adsorption
Retention Time
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분리모드 3 ; Resolution
Theoretical Plate
Selectivity
Retention Factor
TR1
Response
K0 , T0
TR2
Time
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수식으로 보는 분리 : Resolution
R > 1.5 -2.0 : Baseline Resolution
K’ : Capacity Factor /Correct Mobile Phase Strength
α : Selectivity Factor /Right Chemistry
N : Efficiency Factor /Correct Column Dimension
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A.1 Capacity/Retention Factor
∝
R
2<K<10
K’=(Ta-T0)/T0
↑
K
2
5
7.5
10
Mobile Phase Strength ↓ K’ ↑ => R↑
RPC, NPC, IEX, …
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Mobile/Stationary Phase (C18, C8, C4) Strength
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A.2 Selectivity
∝
α > 1.2
α=KA’/KB’
How to Interact with compound
- Stationary/Mobile Phase
- pH
- Temperature
- Additives
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Chemical Selectivity : C18 end capping process
TMS => - CH3
Batch
Synthesis
Flow Synthesis/Microreactor
: Tri step end-capping
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Anthocyanin/Anthocyanidin
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A.3 Efficiency/Speed
∝
5000<N<25000
Clength ↑ N ↑
Dparticle↓ N ↑
R↑
Minimize Extra Column Volume
Mixing Performance
Optimum Velocity(Flow Rate)
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Column의 분리 능 vs 선 속도 : Van Deemter Plot
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Column Dimension Downscale : N/Res.
Peptide Mapping
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Small Particle or Large Particle의 특성
H
E
T
P
TR
2um
5um
5um
2um
선 속도
HETP vs u
N
TR vs N
Column Permeability
Large Peak Capacity => Large Particle Size
Very Fast Separation => Small Particle Size
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5. Reversed Phase Column 선택 하는 법 1
Reversed Phase Column 선택 하는 법 2
Polar, Mid to Non polar Compounds
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Polar Compounds
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Basic Compounds
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Reversed Phase Column 선택 하는 법 3 : SRM 870
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6. 분석 방법 조정가이드 ; USP & FDA
Parameter
컬럼 길이
컬럼 ID
유속
주입량
Particle Size
Max Spec
±70%
FDA ±50%
USP ±25%
컬럼 선 속도 유지
±50%
최대한 적게
감도/재현성 유지
To 50%
* 주요 관공서의 표준방법을 수정할 경우 기존분석법과 수정방법을 동시에 수행하여
정확성, 재현성등 검증조건에 영향을 주지 않아야 합니다.
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a. 조정 시 Validation 고려사항
1. 정확성
2. 정밀성
A.
Ruggedness
System Suitability Guide

Repeatability
•
Resolution > 2

Reproducibility
•
USP Tf < 2
•
Repeatability Area, Tf
3. Selectivity/Specificity
•
Retention Range 2<K>10
4. 직선성
•
Relative Retention RR>1.2
5. Range
•
S/N >10
B. Robustness
6. LOQ : S/N >10
7. LOD : S/N > 3
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b. Isocratic Separation 고려사항
1.
2.
현재 방법 성능

Resolution

USP Tf

Repeatability

S/N ratios
3. 분석조건

컬럼 : Length/Internal
Diameter/Particle Size/
온도

유속
기기 조건

이동상점도

Void Volume :
Mixing/Tubing/Cell
Volume

주입량

시료용매/농도

Data Rate

Backpressure

Cell Path Length

System Pressure
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c. Isocratic/Gradient Separation 고려사항
Isocratic Separation
1. Sample Load
: Vt 의 0.5-1% 이하,
농도 1% 이하
2. Sample 용매 강도 고려
3. System Void Volume
: Mixing/Tubing/Cell Volume
4. Injection 정밀성
: Vinj 변화
5. Data Rate
Gradient Separation
1. Isocratic +
2. Delay Volume
: Backpressure변화
3. Gradient Time : K*
4. Gradient Delay Time
: Gradient Volume/Column
Volume Ratio 유지
5. Post Run Equilibration Time
: Delay Volume x 5 이상
: 25-50 Points/Peak
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Appendix 1. SRM 870
Uracil : Void volume marker
Quinizarin : Activity toward chelating reagent
Toluene : Hydrophobic Retention
Amitriptyline : activity toward bases
Ethylbenzene : Methylene Selectivity
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Reversed Phase Column Chemistry 이해
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Reversed Phase Column Chemistry 이해
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Appendix 2. DAC Column/YMC Prep LC
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Prep Process
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