Transcript 단백질공학.

Pharmaceutical Proteins in Protein
Engineering Area
Yong-Cheol Park
([email protected])
Department of Advanced Fermentation
Fusion Science & Technology
Kookmin University
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Concept of Protein Engineering
 Objectives: production of valuable proteins
with new functions by protein modification
Genetic engineering
단백질공학
Basic area
Basic and application area
• Tool development for
protein overproduction
• Protein design under
specific objectives
• Improvement of industrial
values
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Cycle of Protein Engineering
Wild type protein
Incorporation into
industrial process
Biochemical and structural
characterization
Gene cloning
& overexpression
Selected
mutant protein
Mutagenesis
Screening of mutants
with desired properties
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Protein Engineering
Mutagenesis
Rational design : Site-directed mutagenesis
Non-rational design (random)
: DNA shuffling, directed evolution
Industrial proteins
: protease, glucose isomerase, papain, amylase, cellulase,
xylanase, pectinase, lipase
Pharmaceutical proteins
: peptide, polypeptide vaccine, antibody, transcription factor,
hormone acceptor
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Basic Protein Chemistry
Definition of protein
 생명체를 구성하는 4대 분자(단백질, 지방, 탄수화물, 핵
산) 가운데 생존에 필수적·능동적·생물학적 기능을 나타
내는 물질
 모든 생물체에 기본적으로 20가지 아미노산의 서로 다른
일차적 배열로 이루어짐
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Basic Protein Chemistry
단백질 연구의 중요성
 30억 DNA 염기서열 중, 2~3%의 염기서열이 약 4만여 개의 유
전자를 이룸
 Functional genomics, proteomics, metabolomics 등 여러
high-throughput 기술의 개발로 유전자 발현과 생리적 기능의
상관관계에 대한 연구가 대규모로 이루어짐
 현재 약 500여종으로 알려진 drug target은 post-genome 시대
에는 3,000~10,000여종으로 확대 예상됨
 이중 대부분은 단백질일 것으로 예측됨
 산업적 측면으로의 단백질 공학의 응용사례는 일부 보고됨
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Amino Acids
α-carbon, 카르복실기,
아민기, 수소원자, Rgroup
비극성 지방족
방향족
극성 비전하
양전하
음전하
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Uncommon Amino Acids
 4-Hydroxyproline, 5-hydroxylysine
Collagen(extracellular matrix의 주성분)의 AA.
비타민C를 이용한 prolyl·lysyl hydroxylase에 의해 형성.
비타민C 결핍collagen 형성 억제괴혈병 유발.
 Gamma-Carboxyglutamate
Zymogen(혈액응고에 관여)의 주요 구성 AA.
Calcium 결합을 통한 zymogen activation의 필수요소.
 N-Methyllysine (myosine 구성성분), desmosine (elastine
구성), selenocysteine (glutathione peroxidase의 활성조절)
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Peptide/Protein
 단백질(protein):
삼차원 구조를 형성하여 특정기
능을 나타내는 폴리펩타이드
(polypeptide)
 단위: Dalton (Da)
Formation of a peptide bond
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Biological Active Peptides
 Aspartame (NutaSweet)
Aspartate + phenylalanine
 Oxytocin
자궁수축 peptide hormone, 뇌하수체 후엽에서 분비
 Enkephalin
마취효과, 통증조절역할
 Insulin, glucagon, somatostatin
포도당 활용조절, 췌장에서 분비되는 peptide hormone
 polypeptide형태로 합성된 후, 조직별 특정 단백질 가수분
해에 의해 선택적으로 유도됨. 화학적 합성 가능(Lab-scale)
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Biological Roles of Protein
 효소
생물학적 촉매 (포도당전이효소, 지방분해효소)
세포 내/외의 다양한 물질을 특이적으로 반응시킴
 운반단백질
혈장 내 운반단백질은 특이적인 분자 또는 이온과 결합하여
특정 장기로부터 다른 장기로 물질을 수송함 (헤모글로빈)
 저장단백질
식물종자는 성장에 필요한 영양단백질을 저장함 (난백알부
민, 카제인)
 운동단백질
세포에서 수축과 변형, 운동을 조절함 (액틴, 마이오신)
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Biological Roles of Protein
 구조단백질
생물체의 구조를 강화,보호함 (콜라겐, 엘라스틴, 피브로인)
 방어단백질
다른 생물종의 외부침입으로부터 생체를 방어함 (면역글로
블린, 항체)
 조절단백질
세포활성이나 생리활성을 조절하는 역할(인슐린, 성장호르
몬)
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Protein Structure
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Primary Structure
 Polypeptide chain (amino acid sequence)
 Peptide bond는 탄소와 질소 원자 사이의 부분적 이중결합
으로 형성되어 있어 분자 내 rotation이 불가능
 치환기의 위치는 trans-configuration으로 고정
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Secondary Structure
 견고한 peptide bond에 의한 골격에 의해 형성되는 구조
 입체적 반발(steric hindrance)이 작고 수소결합이 많은 안
정적 구조
 α-helix와 β-sheet
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Tertiary/Quaternary Structure
 Tertiary : secondary structure의 단백질이 다시 공간적으로
접혀서 생성된 특징적인 구조
 Quaternary : tertiary structure의 단백질 사이에서 형성되
는 복합체의 구조 (homopolymer or heteropolymer)
 Peptide chain, water, R-group 간의 ionic interaction,
hydrogen bond, hydrophobic interaction, van der Waals
interaction의 4가지 비공유 결합으로 이루어짐
Myoglobin
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Hemoglobin
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Cloning of DNA in recombinant plasmid
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재조합세포(recombinant cell)
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Chinese hamster ovary cell
Saccharomyces cerevisiae
Human cell
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Protein production
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의약품 이란?
정의 : 질병을 치료하거나 예방에 사용되는 물질을 총칭함
합성약품(Drug)
저분자 유기화합물, 대부분의 경구투여 약품
100% 합성 또는 천연물질에서 기인함
(구조변경으로 효력 증진)
~ 식물유래(알칼로이드 등),
동물유래(성호르몬, 스테로이드 호르몬)
미생물유래
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의약품 이란?
 바이오 의약품(Biopharmaceuticals or biologics)
 고분자의 단백질, 당 단백질 또는 탄수화물제제 (분자량 수십만~수백
만)
 사이토카인, 성장인자, 호르몬, 혈액제제, 백신, 치료용 항체, 치료용 천
연고분자, 체내 진단시약, 핵산치료제, 세포치료제 등등
 재조합 DNA 기술/세포융합기술 등 분자 생물학 기술의 발전으로 대량
생산가능
 2004년 기준 전세계 조제의약품 시장 : 5500억 $
전체의 10%를 차지함 (재조합 단백질, 360억 $; 치료용 항체, 105억
$...)
 But, 합성의약품 시장의 증가율 5% (2004년도)
바이오 의약품 시장의 증가율 17%
(자가면역질환 치료제는 거의 치료용 항체
-항암, 류마티스 관절염 등)
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고지혈증 치료제
고지혈증 치료제
궤양 치료제
뇌졸증 치료제
천식 치료제
고혈압 치료제
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세포증식억제제
위산분비억제제
향정신성약물
혈압조절
적혈구생성촉진
협심증치료/혈압강하
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바이오 의약품의 정의
용어의 정의 : “Biologics” 또는 “Biopharmaceuticals”
Biologics (생물학적 제제)
유전공학 기술에 의한 재조합 의약품이 세상에 등장하기
전에 사용되던 용어
주로 백신이나 혈액 유래의 제품
Biopharmaceuticals (바이오 의약품)
1980년대부터 처음 사용
재조합 DNA 기술에 의해 생산된 재조합 단백질
세포융합기술 등으로 생산된 단클론항체
유전자 요법, 안티센스 기술 등의 핵산 등…
현재 포괄적인 의미로 사용됨
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바이오 의약품의 기원
바이오 의약품의 기원 : 우두바이러스 (Cowpox virus)
1797년 Edward Jenner가 천연두 예방을 위해 환자에 적용
치료용 바이오 의약품의 기원 : 인슐린
1930년대 돼지의 췌장에서 인슐린 대량생산
1920년대 성장호르몬 발견
죽은 사람의 뇌하수체에서 극미량 추출,분리,정제
Crutzfeldt-Jakob disease(광우병과 비슷)가 발병
1957년 인터페론 발견
항바이러스/항종양 효과가 우수
But, 치료용으로 광범위하게 사용하기는 불가능
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해결책
유전자재조합기술 : 1973년 Stanley Cohen과 Hebert Boyer
세포융합기술 : 1975년도
유전자 조작된 미생물/동물세포 이용  단백질 대량생산
질병유발 병원균/바이러스의 오염을 방지  안전성 극복
천연보다 우수한 2세대 재조합 단백질 생산 가능
전통적 추출/분리정제를 유지하는 경우
인간혈청 알부민 : 비용이 더 저렴
혈액인자 : 혼합물 형태가 치료효과가 더 큼
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바이오 의약품의 현황 및 전망
1982년 최초로 인슐린이 재조합 단백질로서 FDA의 허가획득
 비약적인 바이오 의약품 시장의 성장
사이토카인(Cytokines)
인터페론αβγ, 인터류킨II 등
혈구세포 성장인자
(Hemopoietic growth
factors)
백혈구 성장인자(Granulocyte-Colony Stimulating
Factor, G-CSF),
적혈구 성장인자(Erythropoietin),
혈소판 성장인자(Thrombopoietin) 등
성장인자(growth factors) 표피세포 성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)
인슐린 유사 성장인자 (Insulin-like Growth factor,
IGF-1) 등
호르몬(hormones)
인슐린(insulin), 성장호르몬(HGH), 난세포 자극호르
몬(FSH) 등
혈액관련 제품
Factor VIII, factor VIIIa 등
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바이오 의약품의 현황 및 전망
시장성이 큰 제품
EPO : 104억 달러(2004), 빈혈치료제
인슐린 : 당뇨환자
G-CSF: 호중구 감소증 (백혈구 성장인자)
전체 360억 달러, 17% 성장 (2004)
제너릭(Generic)제품의 출현이 많아짐 (2005년, 12.5%성장)
바이오 의약품의 제너릭 제품은 허가된 적이 없음
 이유: 미국/유럽의 뚜렷한 허가기준이 없음
(합성의약품과 달리 불순물 및 항체 생성율에 대한
임상의 필요성이 요구됨)
Sandoz (Novatis자회사, Omnitroph, 성장호르몬),
LG+Biopartner(스위스, Valtropin, 성장호르몬)
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바이오 의약품의 현황 및 전망
바이오 의약품의 formulation
경구 투여가 불가능  피하주사/근육주사
 서방출성 제제 (2~3일  1주일~수개월)
서방출성 제제
Sustain release : 단백질 제제가 서서히 release 됨
Sustained elimination : 분자량증가/변형 단백질로 반감기↑
 분자량 증가시키는 방법
 Pegylation : 단백질에 polyethylene glycol 부착
 알부민과 결합
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제약사업의 특징
High Risk High Return
의약품(신약)개발  10억 달러/평균 12년 이상 연구개발
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제약사업의 특징
Blue ocean
세계 10대 제품 중 Lipitor, Zocor는 한해 수십~100억 달러
15년 이상 특허로 독점적 지위 보호
세계 유수 제약회사의 매출액 대비 이익은 20% 내외
천문학적인 R&D 비용
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