Transcript 2. 1차피부자극시험

안전성과 안정성
(Safety & Stability)
허찬우 화장품연구소
안전성 (Safety)
1. 의약품 : 치료라는 유효성 & 부작용
2. 화장품 : 작용이 경미, 절대적 안전성 필요.
- 불특정 다수가 사용
- 사용법이 사용자의 임의 사항
3. 안전성
- 식품의 경우
GRAS (Generally Recognized As Safe)
- (식품 첨가물에 대한) 미국 FDA에서 지정한 일반적으로
안전한 물질로 인정되는 물질의 목록
- 화장품의 경우
CIR( Cosmetic Ingredient Review) : 미국 PCPC(Personal Care
Products Council)이 기획한 화장품원료의 안전성 재평가 자
료집
Food & Chemical Toxicology : RIFM(Research Institute for
Fragrance Materials)이 화장품의 향료성분에 대한 안전성평
가를 하여 보고하는 저널
국내의 안전성시험
1. 단회투여독성시험
2. 1차피부자극시험
3. 안점막자극 또는 기타점막자극시험
4. 피부감작성시험
5. 광독성시험
6. 광감작성시험
7. 인체사용시험
8. 유전독성시험
1. 단회투여독성시험
가.
나.
다.
라.
실험 동물 : 랫드 또는 마우스
동 물 수 : 1군당 5마리이상
투여경로 : 경구 또는 비경구 투여
용량 단계
: 독성을 파악하기에 적절한 용량단계를 설정한다.
만약, 2,000㎎/㎏이상의 용량에서 시험물질과 관련된 사망
이 나타나지 않는다면 용량단계를 설정할 필요는 없다.
마. 투여 회수 : 1회
바. 관 찰 :
* 독성증상의 종류, 정도, 발현, 추이 및 가역성을 관찰하고 기
록한다.
* 관찰기간은 일반적으로 14일로 한다.
* 관찰기간중 사망례 및 관찰기간 종료시 생존례는 전부 부검
하고, 기관과 조직에 대하여도 필요에 따라 병리조직학적 검
사를 행한다.
2. 1차피부자극시험
가.
나.
다.
라.
마.
바.
사.
아.
자.
차.
Draize방법을 원칙으로 한다.
시험 동물 : 백색 토끼 또는 기니픽
동 물 수 : 3마리 이상
피 부 : 털을 제거한 건강한 피부
투여면적 및 용량
: 피부 1차 자극성을 적절하게 평가시 얻어질 수 있는 면적 및 용량
투여농도 및 용량
: 피부 1차 자극성을 평가하기에 적정한 농도와 용량를 설정한다.
단일농도 투여시에는 0.5ml(액체) 또는 0.5g(고체) 를 투여량으로
한다.
투여 방법 : 24시간 개방 또는 폐쇄첩포
투여 후 처치 : 무처치하지만 필요에 따라서 세정 등의 조작을 행해
도 좋다
관 찰 : 투여 후 24, 48, 72시간의 투여부위의 육안관찰을 행한다
시험결과의 평가
: 피부 1차 자극성을 적절하게 평가 시 얻어지는 채점법으로 결정한
다
3. 안점막자극 또는 기타점막자극시험
가.
나.
다.
라.
Draize방법을 원칙으로 한다.
시험동물 : 백색 토끼
동물수 : 세척군 및 비세척군당 3마리 이상
투여 농도 및 용량
: 안점막자극성을 평가하기에 적정한 농도를 설정하며, 투여 용량은
0.1ml(액체) 또는 0.1g(고체)한다.
마. 투여 방법
: 한쪽눈의 하안검을 안구로부터 당겨서 결막낭내에 투여하고 상하
안검을 약 1초간 서로 맞춘다. 다른쪽 눈을 미처치 그대로 두어 무
처치 대조안으로 한다.
바. 관 찰
: 약물 투여후 1, 24, 48, 72시간후에 눈을 관찰
사. 기타 대표적인 시험방법은 다음과 같은 방법이 있다.
(1) LVET(Low Volume Eye Irritation Test) 법
(2) Oral Mucosal Irritation test 법
(3) Rabbit/Rat Vaginal Mucosal Irritation test 법
(4) Rabbit Penile mucosal Irritation test 법
4. 피부감작성시험
가. 일반적으로 Maximization Test을 사용하지만 적절하다고 판단되는
다른 시험법을 사용할 수 있다.
나. 시험동물 : 기니픽
다. 동 물 수 :원칙적으로 1군당 5마리이상
라. 시험군 : 시험물질감작군, 양성대조감작군, 대조군을 둔다
마. 시험실시요령
: Adjuvant는 사용하는 시험법 및 adjuvant 사용하지 않는 시험법이 있으
나 제1단계로서 Adjuvant를 사용하는 사용법 가운데 1가지를 선택해서
행하고, 만약 양성소견이 얻어진 경우에는 제2단계로서 Adjuvant를
사용하지 않는 시험방법을 추가해서 실시하는 것이 바 람직하다.
바. 시험결과의 평가
: 동물의 피부반응을 시험법에 의거한 판정기준에 따라 평가한다.
사. 대표적인 시험방법은 다음과 같은 방법이 있다.
(1) Adjuvant를 사용하는 시험법
(가) Adjuvant and Patch Test (나) Freund's Complete Adjuvant Test
(다) Maximization Test
(라) Optimization Test
(마) Split Adjuvant Test
(2) Adjuvant를 사용하지 않는 시험법
(바) Buehler Test
(사) Draize Test
(아) Open Epicutaneous Test
5. 광독성시험
가.
다.
라.
마.
바.
사.
아.
자.
일반적으로 기니픽을 사용하는 시험법을 사용한다.
시험동물: 각 시험법에 정한 바에 따른다
동 물 수 : 원칙적으로 1군당 5마리이상
시험군
: 원칙적으로 시험물질투여군 및 적절한 대조군을 둔다
광원
: UV-A 영역의 램프 단독, 혹은 UV-A와 UV-B 영역의 각 램프를
겸용해서 사용한다.
시험실시요령
: 자항의 시험방법 중에서 적절하다고 판단되는 방법을 사용한다
시험결과의 평가
: 동물의 피부반응을 각각의 시험법에 의거한 판정기준에 따라 평가
한다.
대표적인 방법으로 다음과 같은 방법이 있다.
(1) Ison법
(2) Ljunggren법
(3) Morikawa법
(4) Sams법
(5) Stott법
6. 광감작성시험
가.
다.
라.
마.
일반적으로 기니픽을 사용하는 시험법을 사용한다.
시험동물 : 각 시험법에 정한 바에 따른다
동 물 수 : 원칙적으로 1군당 5마리이상
시험군
: 원칙적으로 시험물질투여군 및 적절한 대조군을 둔다
바. 광 원
: UV-A 영역의 램프 단독, 혹은 UV-A와 UV-B 영역의 각 램프를
겸용해서 사용한다.
사. 시험실시요령
: 자항의 시험방법 중에서 적절하다고 판단되는 방법을 사용한다.
시험물질의 감작유도를 증가시키기 위해 adjuvant를 사용할 수 있
다.
아. 시험결과의 평가
: 동물의 피부반응을 각각의 시험법에 의거한 판정기준에 따라 평
가한다.
자. 대표적인 방법으로 다음과 같은 방법이 있다.
(1) Adjuvant and Strip 법
(2) Harber 법
(3) Horio 법
(4) Jordan 법
(5) Kochever 법
(6) Maurer 법
(7) Morikawa 법
(8) Vinson법
7. 인체사용시험
가. 화장품의 신원료는 (1)을,
기능성화장품은 (2)를 시행하여 평가한다.
(1) 인체 첩포 시험 : 피부과 전문의 또는 연구소 및 병원, 기타 관련기관에서
5
년이상 해당시험 경력을 가진 자의 지도하에 수행되어야 한다
(가) 대 상 : 30명 이상
(나) 투여 농도 및 용량
: 원료에 따라서 사용시 농도를 고려해서 여러단계의 농도와 용량을 설정
하여 실시하는데, 완제품의 경우는 제품자체를 사용하여도 된다.
(다) 첩부 부위
: 사람의 상등부(정중선의 부분은 제외)또는 전완부등 인체사용시험을 평
가하기에 적정한 부위를 폐쇄첩포한다.
(라) 관 찰
: 원칙적으로 첩포 24시간후에 patch를 제거하고 제거에 의한 일과성의 홍
반의 소실을 기다려 관찰․판정한다.
(마) 시험결과 및 평가
: 홍반, 부종 등의 정도를 피부과 전문의 또는 이와 동등한 자가 판정하고
평가한다.
(2) 인체 누적첩포시험 : 대표적인 방법으로 다음과 같은 방법이 있다.
(가) Shelanski and Shelanski 법
(나) Draize 법 (Jordan modification)
(다) Kilgman의 Maximization 법
8. 유전독성시험
가. 박테리아를 이용한 복귀돌연변이시험
(1) 시험균주 : 아래 2 균주를 사용한다.
Salmonella typhimurium TA98(또는 TA1537), TA100(또는
TA1535)
(상기 균주 외의 균주를 사용할 경우 : 사유를 명기한다)
(2) 용량단계 :
5단계 이상을 설정하며 매 용량마다 2매 이상의 플레이트를 사용
한다.
(3) 최고용량 :
1) 비독성 시험물질은 원칙적으로 5mg/plate 또는 5㎕/plate 농도.
2) 세포독성 시험물질은 복귀돌연변이체의 수 감소, 기본 성장균
층의 무형성 또는 감소를 나타내는 세포독성 농도.
(4) S9 mix를 첨가한 대사활성화법을 병행하여 수행한다.
(5) 대조군 :
대사활성계의 유, 무에 관계없이 동시에 실시한 균주-특이적 양
성 및 음성 대조물질을 포함한다.
(6) 결과의 판정 : 대사활성계 존재 유, 무에 관계없이 최소 1개 균주
에서 평판 당 복귀된 집락수에 있어서 1개 이상의 농도에서 재현
성 있는 증가를 나타낼 때 양성으로 판정한다.
나. 포유류 배양세포를 이용한 체외 염색체이상시험
(1) 시험세포주 : 사람 또는 포유동물의 초대 또는 계대배양세포를 사
용한다.
(2) 용량단계 :
3단계 이상을 설정한다.
(3) 최고용량 :
1) 비독성 시험물질은 5㎕/ml, 5mg/ml 또는 10mM 상당의 농도.
2) 세포독성 시험물질은 집약적 세포 단층의 정도, 세포 수 또는
유사분열 지표에서의 50% 이상의 감소를 나타내는 농도.
(4) S9 mix를 첨가한 대사활성화법을 병행하여 수행한다.
(5) 염색체 표본은 시험물질 처리후 적절한 시기에 제작한다.
(6) 염색체이상의 검색은 농도당 100개의 분열중기상에 대하여 염색
체의 구조이상 및 숫적이상을 가진 세포의 출현빈도를 구한다.
(7) 대조군 : 대사활성계의 유, 무에 관계없이 적합한 양성과 음성대
조군들을 포함한다. 양성대조군은 알려진 염색체이상 유발 물질
을 사용해야 한다.
(8) 결과의 판정 :
염색체이상을 가진 분열중기상의 수가 통계학적으로 유의성 있게
용량 의존적으로 증가하거나, 하나 이상의 용량단계에서 재현성
있게 양성반응을 나타낼 경우를 양성으로 한다.
다. 설치류 조혈세포를 이용한 체내 소핵 시험
(1) 시험동물 : 마우스나 랫드를 사용한다.
일반적으로 1군당 성숙한 수컷 5마리를 사용하며 물질의 특성에
따라 암컷을 사용할 수 있다.
(2) 용량단계 : 3단계 이상으로 한다
(3) 최고용량 :
1) 더 높은 처리용량이 치사를 예상하게 하는 독성의 징후를 나타
내는 용량. 또는
2) 골수 혹은 말초혈액에서 전체 적혈구 가운데 미성숙 적혈구의
비율 감소를 나타내는 용량 시험물질의 특성에 따라 선정한다.
(4) 투여경로 : 복강투여 또는 기타 적용경로로 한다.
(5) 투여회수 : 1회 투여를 원칙으로 하며 필요에 따라 24시간 간격
으로 2회 이상 연속 투여한다.
(6) 대조군은 병행실시한 양성과 음성 대조군을 포함한다.
(7) 시험물질 투여 후 적절한 시기에 골수도말표본을 만든다.
개체당 1,000개의 다염성적혈구에서 소핵의 출현빈도를 계수한
다. 동시에 전적혈구에 대한 다염성적혈구의 출현빈도를 구한다.
(8) 결과의 판정 :
소핵을 가진 다염성적혈구의 수가 통계학적으로 유의성 있게 용
량 의존적으로 증가하거나, 하나 이상의 용량단계에서 재현성 있
게 양성반응을 나타낼 경우를 양성으로 한다.
동물실험 대체법
1. 동물대체 시험법 : 3R
1) 가능한 한 이용되는 동물의 수를 줄이고 (Reduction)
2) 고통을 주지않고 많은 정보를 얻고 (Refinement)
3) 가능한 한 대체법으로 평가 (Replacement)
2. 대체법 개발
: EU에서는 2003년부터 2013년사이 단계적으로 화장품원료 및 제품
에 대하여 동물실험금지 조치(2009년부터 완전 금지 및 불매)
1) 영국 : 1973년 의학실험용 동물 대체 기금(FRAME)이 동물실험
대체법의 기술개발을 위해 설립
2) 미국 : 1981년 화장품업계의 자금원조로 Johns Hopkins대학에
대체법 검토을 위한 CAAT(Center of Alternatives to
Animal Testing) 설립
3) 일본 : 1989년 일본 동물실험 대체법 학회 발족
4) 한국 : 2006년 한국 동물실험 대체법 학회 발족
2008년 식약청 화장품 독성시험 동물대체시험법 가이드라
인 발표
3. 기타:
1) 독성이나 자극성 평가는 과학적으로 우수해야,
2) 시험결과의 평가(Safety Evaluation)와 동시에 실제 사용 상황에
근거한 안전성 확인이나 위험성예측(Risk Assessment)가 중요
3) 이를 위한 평가법의 연구도 중요
안정성(Stability)
* 화장품 및 소재의 품질 안정성
- 메이커로부터 소비자의 손에 이르기까지의 각종 유통경로와
실제 사용기간을 고려한 품질 보증
* 기제의 안정성과 각종 보증시험
- 화학적 열화 : 변색, 퇴색, 변취, 오염, 결정 석출 등
- 물리적 열화 : 분리, 침전, 응집, 발분, 발한, 겔화, 얼룩짐, 휘발,
고화, 연화, 균열 등
1. 일반적 보존시험
1) 온도 안정성시험
(1) 설정온도 : -10℃, -5℃, 0℃, 25℃, 실온, 30℃, 37℃, 45℃,
50℃, 60℃ 등
(2) 보존기간 : 1일 – 1개월, 2개월, 6개월, 1-3년
(3) 관찰항목
- 외관변화 : 색조차, 변퇴색, 선/색 얼룩짐, 이물질혼입, 흠,
부유물, 분리, 침전, 발한, 부유, 균열, 겔화,
투명성, 케이킹, 함몰, 핀홀, 기포혼입, 곰팡이 등
- 냄새변화 : 직접, 용기의 냄새변화, 사용 시 냄새.
(4) 측정항목 및 대표적 측정기기
- pH : 유리전극 pH 메터
- 경도: 카드텐션 메터, 비커스경도계, 올젠경도계, 레오메터 등
- 점도: 브룩필드점도계, 레드우드형 점도계, 플레이트형 점도
계
- 탁도: 적분구식 탁도계, 집중광원법
- 입자크기: 현미경, 쿨터카운터 등
- 유화형 : 테스터
- 수분휘산 : 건조감량법, 칼핏셔법, 증류법
(5) 평가 ; 각 항목별, 시간별 데이터 기록. 5점법 등으로 안정성의
범위 결정 – 보다 안정한 시스템 설계
2) 광안정성시험(내광성)
: 화장품 진열 상태 – 직접 햇빛을 받는 곳에 진열,
- 쇼윈도 등
: 광안정성 보증 시험
(1) 옥외(일광) 폭로시험
- 한여름, 수일, 수주, 수개월 설정
- 주로 색조변화 ,냄새 변화 등
(2) 실내(인공광) 폭로시험
- 일정한 조건
- 크세논아크램프 : 일광과 가장 가까운 인공광원
(3) 형광등 폭로시험
- 쇼케이스의 형광등 조건
2. 일반성능/효과 확인시험
- 온도 및 광안정성시험에 따른 화장품의 본래의 성능과 효과의 변
화 여부 측정
1) 기초화장품 : 퍼짐, 끈적임 등의 사용성, 광택, 세정력, 기포력 등
2) 메이크업화장품
(1) 분말화장품 : 화장지속성, 은폐력, 도포색의 변화
(2) 포인트메이크업 : 박리, 광택, 건조속도, 화장지속성, 염착성,
내수성, 내유성 등
(3) 모발화장품 : 세팅력, 웨이브력의 지속성, 광택에 대한 영향,
염착력, 탈색력, 탈모력 등
3. 에어로졸제품의 안정성시험
- 액화가스 또는 압축가스 사용
- 최종품의 안정성은 별도
1) 부식시험
- 정립, 또는 도립상태
- 실온, 고온, 단기간 – 장기간 방치후
- 뚜껑을 열어 부식의 유무 관찰
2) 누설시험
- 중량의 변화 측정
3) 막힘시험
- 내용물의 분사상태의 변화 측정
기능성소재의 안정성시험
* 목적 : 의약품 등의 저장방법 및 사용기간을 설정하기 위한 시험
* 종류
1) 장기보존시험 : 의약품등의 저장조건하에서 사용기간(또는 유효기
간)을 설정하기 위하여 장기간에 걸쳐 의약품등의
물리화학 및 생물학적 안정성을 확인하는 시험
2) 가혹시험 : 가혹조건 하에서 의약품등의 분해과정 및 분해산물 등
을 확인하기 위한 시험
3) 가속시험 : 장기보존시험의 저장조건을 벗어난 단기간의 가속조건
이 의약품등의 안정성에 미치는 영향을 평가하기 위한
시험
장기보존 시험기준
1. 검체수 : 시판할 제품과 동일한 처방, 제형 및 포장용기를 사용하여
3개로트 이상으로 한다.
2. 보존조건 : 25±2℃/ 상대습도 60±5%로 한다.
다만, 다른 저장온도가 설정된 경우에는 그 설정온도로 한다.
3. 시험기간: 12개월 이상을 원칙으로 하며 적어도 설정한 사용기간
이상 시험하여야 한다.
4. 측정시기: 시험개시 때와 첫 1년간은 3개월마다,
그 후 2년까지는 6개월마다,
2년이후부터는 1년에 1회 시험한다.
- 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36 개월 등
5. 시험항목: 기준 및 시험방법에 설정한 전 항목을 원칙으로 한다.
6. 시험회수: 각 시험항목 별로 3회 이상 실시하여 그 평균치를
기재한다.
가속시험
1. 검체수: 시판할 제품과 동일한 처방, 제형등 포장용기를 사용하여
3개 로트 이상으로 한다.
2. 보존조건: 40±2℃/ 상대습도 75±5% 또는 장기보존시험 지정저장
온도+15℃이상(온도에 따른 적절한 상대습도 고려)으로
한다.
3. 시험기간: 6개월 이상을 원칙으로 한다.
4. 측정시기: 시험개시 때를 포함하여 일정한 간격의 4개 시점 이상으
로 한다. – 0, 2, 4, 6 개월
5. 추가시험: 가속시험에서 유의성있는 변화가 발생하면 중간조건(예를
들면 30±2℃/ 상대습도 60±5%)에서 1년간의 추가가속
시험이 이루어져야 한다.
* 가속시험의 유의성 있는 변화
가. 한 로트에서 항목별시험기준보다 5%이상의 함량변화가 있는 경우
나. 규격치를 초과하는 변성물질이 검출된 경우
다. pH 범위를 초과하는 경우
6. 시험항목 및 회수: 장기보존시험 시험기준에 따른다.
7. 상기 보존조건 및 시험기간 등이 가속시험 목적에 부적당하거나 경
시변화가 일어나기 쉽다고 판단되는 경우에는 장기보존시험기준에
따른다.
가혹시험
1. 시험조건: 광선, 온도, 습도의 3 조건을 검체의 특성을 고려하여 설
정한다. 다만, 검체가 원료인 경우에는 수용액상태에서의
시험조건(광선, 온도, pH)을 포함하여 시험한다.
2. 시험항목: 품질관리상 중요한 항목 및 분해산물 생성유무를 확인 및
정량하여야 하며, 중요한 분해산물에 대하여는 그에 대한
물리화학적 성질, 독성 및 약리시험자료등을 제출하여야
한다.
3. 검체수, 시험기간, 시험회수등 : 검체의 특성 및 시험조건에 따라 적
절히 정한다.
불안정한 기제의 안정화
1. 산소를 차단하는 방법
2. 산화방지제의 혼합
3. pH 조절제의 혼합
4. 금속이온봉쇄제의 배합
5. 최적 배합량의 수준 연구
6. 불순물의 제거
7. 저온 유화 와 후 첨가혼합 등 생산공정에 관련된 온도 안정성 연구
8. 원료단계에서의 안정된 보관(냉암소보관) 등
9. 용기의 선택 및 제형 선택
대량생산에 의한 안정성의 변화
* 실험실 생산품의 안정도와 공장생산품의 안정도의 차이 발행
1. 원재료 로트의 불균일
2. 제조조건(온도, 절단력, 제조시간, 첨가방법, 순서)의 차
3. 충진조건(과냉각, 재용해, 기계에 의한 절단력, 연속성)의 차
4. 제조량 (1kg – 2 ton, 10 ton)
화장품의 방부 방미
* 필요성
- 오일과 물을 주성분
- 글리세린, 소르비톨 등 : 미생물의 탄소원
- 아미노산유도체, 단백질 : 미생물의 질소원
: 식품과 마찬가지로 곰팡이와 세균 등 미생물의 침투 용이.
* 미생물의 일반적인 성질
항목
곰팡이
효모
세균(박테리아)
생육온도
20-30℃
25-30 ℃
25-37 ℃
영양소
전분질,
식물성식품
당질
식물성식품
단백질/아미노산
동물성식품
생육 pH 영역 산성
산성
약산-약알칼리
공기(산소)의
요구성
호기성
호기성-혐기성
호기성이 보통
혐기성도 잇다
주생산물
산류
알코올, 산류,
탄산가스
아민/암모니아,
산류, 탄산가스
대표적
오염균
Penicillium
Aspergillus
Rhizopus
Saccharomyces
Bacillus subtilis
Candida albicans Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
오염의 단계
1. 1차 오염 : Primary contamination
- 공장에서의 제조에 기인하는 미생물오염
- 물에 기인한 세균(그램음성균)
- 대책
: 환기 중 먼지의 필터여과와제습
: 물의 가열살균 및 자외선 살균
; 작업원에 대한 청결한 작업에 대한 교육
2. 2차 오염 : Secondary contamination
- 소비자가 사용 중에 일어나는 미생물오염
- 손가락과 환경에 기인한 세균(그램양성균)
- 대책 : 방부 방미제 배합
항균제
1. 방부 방미제
- 화장품에 배합되어 외부로부터의 오염되는 미생물의 증식을 억제,
사멸시키는 역할
- 파라안식향산 에스테르(메칠파라벤, ----)
- 4급 암모늄염 등
2. 살균제
- 피부에 도포함으로써 피부면을 소독하여 청결
3. 항균제의 필요조건
- 여러종류의 미생물에 효과적
- 수용성 또는 통상 사용되는 성분에 용해성
- 안전성이 높고, 피부자극이 없는 것
- 중성으로 제품의 pH에 영향이 없는 것
- 제품의 성분에 의해 효과가 감소되지 않는 것
- 제품의 외관(변색 등)을 손상시키지 않는 것
- 폭넓은 온도영역, pH영역에서 안정
- 입수 용이, 공급이 안정된 것
- 경제성이 있는 것
*화장품에 많이 쓰이는 항균제들의 종류 및 특성
* 사용농도는 현재의 규정과 틀릴 수 있음.