Transcript Fumarate_Hydratase-Amalina_Ghaisani_Komarudin_10507008

Fumarate hydratase
(EC. 4.2.1.2)
Amalina Ghaisani Komarudin
10507008
Program Studi Kimia
Institut Teknologi Bandung
Agenda Presentasi
•
•
•
•
•
•
•
•
Pendahuluan
Struktur Fumarase
Mekanisme Fumarase
Isolasi Fumarase
Pemurnian Fumarase
Karakterisasi Fumarase
Kinetika Fumarase
Defisiensi Fumarase
Pendahuluan
Siklus Krebs
Reaksi yang Dikatalisis
Reaction: (S)-malate = fumarate + H2O
Tata nama enzim Fumarase
Fumarase (EC. 4.2.1.2)
Lyase
Carbon-Oxygen Lyase
EC 4 : Lyase
EC 3.1 : Carbon-Oxygen Lyase
EC 3.1.1 :Hydro-Lyase
Accepted name: Fumarate Hydratase
Hydro Lyase
Penggolongan Enzim Fumarase
Fumarase
Class I
Class II
Fumarase A,
Fumarase B
Fumarase C
•Klasifikasi berdasarkan penyusunan
subunit, kebutuhan logam dan
ketermostabilan.
• Prokaryot memiliki tiga jenis
Fumarase : Fumarase A, Fumarase B
dan Fumarase C
Struktur Fumarase C dari E.coli
Terdiri dari tiga domain,
dimana posisi region 1-3
berjauhan
Memiliki dua buah
dicarboxylate binding site
yaitu A site dan B site
A site dan B site
teridentifikasi memiliki
area yang tidak terisi ligan
Residu pada sisi aktif
Fumarase
Mekanisme Enzim Fumarase
Isolasi Fumarase Euglena gracilis var.
bacillaris
E. gracilis
• + buffer 1 (50 mM
triethanolamine-HCl pH
7.8
• + malate 10 mM
• 5 mM EDTA
• 10 mM 2mercaptoethanol
• Diisolasi dari sel yang
kekurangan vitamin B12 menggunakan
metode Trypsin
digestion
• Dimurnikan dengan
sentrifugasi gradien
densitas
Fumarase
Pemurnian Fumarase Euglena gracilis
var. bacillaris
• + 70 mL buffer
• French pressure cell pada
10.000 lb/in2
•Sentrifugasi 27.000 x g
selama 30 menit
50 g sel
Crude extract
•Dipanaskan pada suhu 50o C selama
3,5 menit
•Sentrifugasi pada 27.000 x g selama
20 menit
Supernatan
pH dibuat menjadi 7.8
dengan 2 M triethanolamine
Fraksinasi dengan
amonium sulfat 40 % dan
60 %
Ekstrak enzim
Pemurnian Fumarase Euglena gracilis
var. Bacillaris (lanjutan)
Dialisis dengan bufer
•selama
3 jam
•Sentrifugasi
Supernatan
Hasil fraksinasi
• Ditambah NADH, NAD+, NADPH,
NADP+
Kromatografi afinitasMatrix
gel Orange A
Karakterisasi
Fumarase
Karakterisasi Fumarase
Aktifitas
enzim
• + 2 mL 50 mM potassium phospate
• + 50 mM malat
• Diukur serapan pada l 250 nm( 1
Unit enzim = 1 mmol fumarat/menit)
Berat
molekul
• SDS-PAGE (gel 10%)
• Native-PAGE
Hasil elektroforesis
Parameter kinetika Enzim Fumarase
•Aktivitas maksimum pada pH 8,4
• Km Malat = 0,14 mM
• Km Fumarat = 0,031 mM
• ATP merupakan inhibitor
• Pada 10 mM Tris-acetate (pH 7.3)
dan konsentrasi malat= 1 mM, 32,2
mU E. gracilis fumarase terinhibisi
50% oleh 0,35 mM ATP.
Defisiensi Enzim Fumarase
• Defisiensi fumarase
disebabkan oleh mutasi gen
yang mengkode fumarase
• Kekurangan Fumarase
menyebabkan ensefalopati,
retardasi mental yang berat,
fitur wajah yang tidak biasa,
kelainan otak, dan serangan
epilepsi karena jumlah
abnormal rendah fumarase
dalam sel.
• Pola penurunan penyakit ini
adalah autosomal resesif
Referensi
• Purification, Characterization and Immunological Properties of Fumarase
from Euglena gracilis var. Bacilaris. Hitoshi Shibata, William E. Gardiner,
Steven D. Schwartzbach. Journal of Bacteriology, Nov. 1985, P. 762-768
• The role of the allosteric B site in the fumarase reaction. Irwin A. Rose and
Todd M. Weaver. www.pnas.orgcgidoi10.1073pnas.0307524101
• Structure of Free Fumarase C from Escherichia coli . Todd Weaver. Acta
Cryst. (2005). D61. 1395-1401
SEKIAN DAN TERIMA KASIH