Transcript PREİMPLANTASYON GENETİK TANI Hazırlayan: E. Sacide ÇAĞLAYAN

PREİMPLANTASYON
GENETİK TANI
Hazırlayan: E. Sacide ÇAĞLAYAN
Genetik Bir Hastalık İçin Risk Taşıyan Çift

Noninvazif Prenatal Tanı
*Ultrasonografi,İTT, ÜTT, Maternal AFP Testi

İnvazif Prenatal Tanı
*CVS, Amniyosentez, Kordosentez,

Preimplantasyon Genetik Test Sistemleri (PGT)
*Prenatal genetik tanı (PGD), Prenatal genetik tarama (PGS)

PGT, genetik açıdan hastalıklı çocuk sahibi olma riski
çok yüksek aileler için konvansiyonel prenatal tanı
yöntemlerinden daha avantajlı bir uygulamadır.

Gebelik öncesinde, yardımcı üreme teknikleri ile elde
edilen embriyoların genetik analizinin yapılması esasına
dayanır.
PGT

PGD:
Başvuran çift etkilenmiştir (kendisinde ve
ailesinde genetik hastalık bulunur)
*PCR, FISH,CGH

PGS:
Başvuran çift etkilenmemiştir
*FISH
Tarihçe

1968 yılında, Edwards ve Gardner, ilk ebriyo biyopsisini tavşanlar
üzerinde denemiştir.

İnsanlarda, ilk PGD denemesi 80’li yılların ortalarında, prenatal
tanı yöntemlerine alternatif olarak geliştirilmiştir.

Başlangıçta, PGD, X’e bağlı kalıtımı önlemek için cinsiyet
belirlenmesi ile ilgilenmiştir.

1989’da Handyside ve ekibinin uyguladığı, X’e bağlı kalıtılan bir
hastalık için ilk PGD denemesi ile sağlıklı bir doğum
gerçekleştirilmiştir.

2006 yılına kadar,15.000’den fazla PGD uygulaması
rapor edilmiştir.

Günümüzde PGD ile, bir çok genetik mutasyon
belirlenebilmektedir.

PGD, günümüzde sağlam bir şekilde
uygulanabilmektedir ancak PGS hala yeni, yavaş yavaş
gelişen ve tartışılan bir yöntemdir.
PGD’nin Önemi

Genetik bir hastalığı kalıtma riski çok yüksek
olan çiftlere uygulanır.

Sadece etkilenmemiş ve sağlıklı embriyoların
uterusa transferi yapıldığından erken veya geç
dönemde yaşanan abortus veya gebeliğin
sonlandırılması gibi travmatik durumlar
önlenmektedir.

PGD 3 temel hastalık grubu için önerilmektedir.
1) Cinsiyete bağlı kalıtılan hastalıklar
2) Tek gen hastalıkları
3) Kromozomal Düzensizlikler

Günümüzde multifaktöriyel hastalıklara ve
nonmendeliyen hastalıklara yönelik PGD uygulamaları
de yapılabilmektedir
Cinsiyete Bağlı Kalıtılan Hastalıklar

X’e bağlı kalıtılan hastalıkların bir sonraki nesle aktarılmasından
taşıyıcı bir anne sorumludur.

Taşıyıcı anne, anormal X kromozomunu erkek çocuğuna
aktardığında hastalık ortaya çıkar, çünkü babadaki normal X’in
geçişi olmaz.

Etkilenmiş babanın erkek çocuklarının tamamı normal olurken,
kız çocukları taşıyıcı olur.

Hemofili, frajil X ve birçok musküler distrofi (resesif)

Rett sendromu ve psödohiperparatiroidizm (dominant)
Tek Gen Hastalıkları

Bu tip hastalıkların tanımlanmasında, PCR temelli moleküler teknikler
uygulanmaktadır.

En önemli sorunlardan biri çok sayıda mutasyon içeren hastalıkların analizinde
yaşanmaktadır.

Birçok nadir mutasyon rutin olarak çalışılamamkta ve klinik belirtisi olmayan
bir çiftin taşıyıcı olma riski bulunmaktadır

Kistik Fibroz (CF), Tay-Sachs, Orak Hücre Anemisi ve Huntington

BRCA-1 (spesifik bir hastalık nedeni değil ancak bir grup hastalık için risk
artışına yol açan mutasyonlar)
PGT – Tek gen hastalıları
OTOZOMAL RESESSİF
OTOZOMAL DOMINANT
Kistik fibrozsis (various mutations)
Tay Sachs hastalığı
-talassaemi
Orak hüreli anemi
Rh grubu tayini
Spinal müsküler atrofi
Adrenogenital sendrom
Konjential adrenal hiperplazi
Epidermolizis bülloza
Gaucher hastalığı
Fanconi anemisi
HLA uyumu
Marfan sendromu
Charcot-Marie Tooth hastalığı (type 1A)
Crouzons sendromu
NF2
Osteogenesis impeerfekta I and IV
Stickler sendromu
Tuberoz skleroz
Familyal adenomatöz polypozis koli
Li Fraumeni sendromu
Retinoblastoma
Üçlü tekrar hastalıkları
Frajile X
Miyotonik distrofi
Huntington hastalığı
X’e bağlı
Lesch Nyhan sendromu
Duchenne kas distrofisi
Charcot-Marie Tooth hastalığı
Retinitis pigmentoza
Ornitin Transkarbamilaz
Hemofili
Agammaglobulinemi
Alport sendromu
Hunter sendromu MPSII
Oro-facial-digital sendrom tip I
Kromozomal Düzensizlikler

Translokasyon, delesyon, insersiyon gibi yapısal
düzensizlikler Floresans In Situ Hibridizasyon (FISH)
tekniği ile belirli bir lokusa spesifik, telomerik problar
kullanılarak belirlenmektedir

Bazı çiftler, PGD uygulanmadan, kendiliğinden oluşan
bir gebelikle çocuk sahibi olamamaktadır, çünkü önceki
konsepsiyonlarda dengesiz kromozomal düzensizlik
spontan düşüklere yol açmaktadır.
PGS ve Endikasyonları

Yüksek risk taşıyan hastalarda anöploidi
taramaları amacıyla yapılır.

PGS için gerekli endikasyonlar:
İleri maternal yaş
Tekrarlayan gebelik kaybı öyküsü
Tekrarlayan IVF başarısızlığı
İnfertilitede erkeğe bağlı faktörler
I.
II.
III.
IV.
PGS

Embriyoda anöploidi riski, anne 35-39 yaş arasında ise %20’den
daha yüksekken, 40 yaş ve üzerinde yaklaşık %40 civarındadır.

Bu tip olguların birçoğu, gebelikten kuşkulanmadan önce
kaybedildiği için fark edilememektedir

PGS uygulaması ile sağlıklı gebelik oluşma ihtimali artarken,
düşük veya etkilenmiş embriyo oluşumu riski düşmektedir.
PGD ve Cinsiyet Belirlenmesi

Kültürel, etnik, sosyal ve psikolojik nedenlerden
dolayı, bazı durumlarda arzu edilen cinsiyette
çocuk sahibi olmak için PGD’den yardım almayı
taleb eden çiftler olabilmektedir.

Bu tip uygulamalara yaklaşım toplumdan
topluma değişebilmekle birlikte hala yoğun
olarak tartışılmaktadır.
PGT’nin AŞAMALARI
1) IVF
2) TEK HÜCRE BİYOPSİSİ
3) GENETİK TESTLER
4) EMBRİYO TRANSFERİ
IVF





Ovaryan Stimulasyon
Foliküler Aspirasyon
Maturasyon İçin Bekleme
İntrasitoplazmik Sperm İnjeksiyonu (ICSI)
Fertilizasyon Sonrası Embriyonik Gelişim İçin
Kültür Süreci
TEK HÜCRE BİYOPSİSİ

Polar body biyopsisi

Yarıklanma aşamasında embriyo biyopsisi

Blastosit biyopsisi
İlk gün
İnsan Oositi
Hazırlanmış Sperm
Intrasitoplazmik Sperm Injeksiyonu
(ICSI)
2. gün
2 hücreli embriyo
4 hücreli embriyo
3. Gün


8 hücreli embriyo (72
saat)
Yarıklanma aşamasında
biyopsi (blastomerler)
5/6. günler


Blastosist
Biyopsi ?
Blastomer biyopsisi (3.gün)
Kutup cismi biyopsisi
PGD’DE KULLANILAN GENETİK
TESTLER

PCR

FISH

CGH
PCR (DNA Amplifikasyonu)

Genellikle, dominant veya resesif hastalıkları kapsayan tek gen defektlerinin
belirlenmesinde kullanılmaktadır.

DNA molekülü, nükleotid bazlara ve primere tutunmayan DNA polimeraz
enzimi içeren bir solusyonla muamele edilir.

Yüksek ısıda DNA iplikleri arasındaki bağlar yıkılır. Isı düşürüldüğünde, DNA
polimeraz serbest nükleotid bazları primere bağlayarak hızlı bir şekilde yeni
iplikler sentezler.

İki primer arasındaki boşluğun tamamlanması ile yeni bir iplik sentezlenmiş
olur.

Bu işlemin defalarca tekrarlanması ile, birkaç saat içinde DNA’nın küçük bir
kısmının milyarlarca kopyası oluşturulmaktadır.

Bu yöntem bir çok PGT protokolünde yer almaktadır.

Burada, yeterli miktarda ve yüksek kalitede saf DNA molekülü elde etmek
gerekir ve bazı durumlarda polar body ve blastomer gibi tek bir hücrede bunu
gerçekleştirebilme hususunda güçlükler yaşanabilir

Allelik dropout ve laboratuvar kontaminasyonu da yaşanabilecek önemli
komplikasyonlardır.

PGD’de tek bir hücre amplifiye edilmelidir.

ICSI işleminde maternal ve paternal kaynaklı kontaminasyonun mümkün
olduğunca önlenmesi gerekmektedir.

PCR’dan kaynaklanan hatalar, etkilenmiş bir
embriyonun transferi veya normal bir
embriyonun fark edilememesine neden olabilir
(Ör: allelik dropout).

Otozomal dominant hastalıklarda etkilenmiş bir
embriyonun transfer riski %11, resesif
hastalıklarda ise %2’dir.
PGD’de PCR Uygulamaları:

Otozomal hastalıklarda tek gen defektlerinin
belirlenmesi

Erkek infertilitesinde tek gen defektlerinin
belirlenmesinde

X’e bağlı hastalıklarda cinsiyet tayininde
FISH

Özellikle, X’e bağlı kalıtılan hastalıklarda cinsiyet tayini, kromozomal
düzensizlikler ve anöploidi taramalarında kullanılmaktadır.

Anöploidi taramalarında sağladığı kolaylık nedeniyle PGS’de daha yaygın
kullanılır.

Bu işelmde, incelenecek kromozomla eşleşmek üzere prob (her prob farklı
boya ile işaretli) adı verilen küçük DNA molekülleri kullanılmaktadır.

Floresans mikroskobu ile yapılan inceleme sonucu her kromozom renklere
göre ayırdedilir.

Analiz edilebilecek kromozomlar 13,16,18, 21, (22),X ve Y’dir.
FISH Yöntemi
►Denatürasyon
. 730 C 5 dakika
►Hibridizasyon
. 370 C 3 saat
►Hibridizasyon sonrası yıkama
. 2 dakika 0.4XSSC
►Analiz
 Hangi
kromozomlar analiz
ediliyor?
 X,
Y, 13, 18, 21
 13,
16, 18, 21, 22
18
16
18
21
13
22
13
21
16
22
NORMAL FISH
Trizomi 13 (Blastomer nükleusu)
CGH

Embriyo nükleusu floresans bir boya ile işaretlenirken, bir
kontrol hücresi farklı bir boya (genellikle yeşil) ile işaretlenir.

İki hücrenin daha sonra kontrol metafaz plağında
kohibridizasyonu gerçekleşir.

İki renk yoğunluğu arasındaki fark karşılaştırılır.

Kırmızı renk fazla ise embriyo nükleusu ekstra kromozom
içermekte, yeşil yoğunluğu fazla ise embriyoda eksik kromozom
bulunmaktadır.

Bu teknik yaklaşık 72 saati almaktadır.
PGD UYGULAMALARINDA DİKKAT EDİLECEK
HUSUSLAR

İnfertilite problemi olmayan hastalar IVF için yönlendirilir ve IVF tedavisi ile
ilişkili riskler hakkında bilgilendirilir.

Hastalara, PGD için yapılacak IVF işlemi hakkında genetik danışma mutlaka
verilmelidir, ilgili kalıtım paternleri ve hastalığın etkilenmiş çocuk ve aile
üzerindeki olası etkileri detaylı olarak anlatılmalıdır.

PGD veya PGS uygulaması yapılacak olsa bile hastalara prenatal tanı
(amniyosentez, CVS, kordosentez) hakkında mutlaka bilgi verilmelidir.

Donör gametlerinin kullanılması gibi alternatif tedavi stratejileri de
tartışılmalıdır.

Başarılı bir IVF ve PGD gerçekleşse bile transferden sonra gebelik,
zamanında veya erken doğum garanti edilmez.

Hücrenin zedelenmeden veya ciddi bir hasara uğramadan alınması işlemi
teknik olarak oldukça zordur, beceri ve deneyim gerektirmektedir.
Embriyonun kazaya bağlı olarak yaklaşık %0.1 oranaında hasar görme riski
bulunmaktadır

Yeni bir hastalığa yönelik tanısal metodoloji zaman alıcı ve pahalı bir süreçtir.

Tek bir hücrenin analiz ediliyor olması bazı sınırlamaları da beraberinde getirir.
Eğer embriyoda farklı hücre hatları bir arada bulunuyorsa mozaisizm
belirlenemez.

Bu sebeple, özellikle amniyosentez gibi prenatal tanı testleri ile sonuç
doğrulanmalıdır.

Bazı durumlarda, çok sayıda yumurta hücresi veya embriyo anormal olarak
belirlenebilir. Bu sebeple az sayıda embriyo transfer edilebilir veya embriyo
transferi mümkün olmaz.

Anöploidi taramalarında, PGD ile tüm kromozomlar veya tüm
anomaliler tanımlanamamaktadır. Çünkü bir test protokolünde,
bir uygulamada sınırlı sayıda kromozom analiz edilebilir.

Günümüzde, bir hücre biyopsisinde tek tip genetik araştırma
uygulanabilmektedir. Çok sayıda genetik araştırmanın aynı anda
yapılması mümkün değildir.

Kistik fibroz gibi çok sayıda mutasyonun görüldüğü tek gen
hastalıklarında PGD, ikna edici olmayabilir. Bu durumda çiftlere
yeni probların oluşturulmasını gerektiren spesifik testler
uygulanmalıdır . Yeni probların üretilme süreci birkaç haftayı
almaktadır.
PGT’de olası yanlış tanı nedenleri

PCR
Allel dropout
 Kontaminasyon




sperm/kumulus/DNA/hücreler
Mozaiklik
FISH

Kontaminasyon


Kumulus hücreleri
Mozaiklik
Çözüm:
Prenatal Tanı
PGS UYGULAMALARINDA DİKKAT
EDİLECEK HUSUSLAR
“
PGS günümüzde hala tartışılan bir
yöntemdir. Başlangıçta maternal yaşa bağlı risk
artışında embriyoda anöploidiyi önlemek için
umut verici bir gelişme olarak kabul edilse de,
son çalışmalar belirli populasyonlarda başarının
sınırlı olduğunu göstermiştir.
Tekniksel Sınırlılıklar: Günümüzde, FISH
yöntemi ile 9-11 kromozom analizi mümkündür.
CGH ve FISH ile yapılan çalışmalarda,
embriyodaki anöploidi %25 oranında belirlenir
ve normal olarak tanımlanır, anormal
kromozomlar belirlenmez. Analiz edilen
hücrelerin yaklaşık %10’una sonuç verilemez
veya tereddüt yaşanır.
Tek Hücre Analizinin Sınırlılıkları:
Nondisjunction mayoz esnasında oluşmuşsa,
embriyoya ait tüm hücrelerde anöploidi görülür.
Ancak, mitoz esnasında oluşmuşsa, embriyoda
iki veya daha fazla hücre hattı bulunabilir. Tek
hücre biyopsisi, embriyodaki mozaisizmin
belirlenmesinde yeterli değildir.
Self-Correction: Mozaik bir embriyonun,
anormal hücrelerin proliferasyonunu
durdurabilme özelliği sonucu, anöploidi
tanımlanmış çoğu embriyonun hayatta kalarak,
yeniden analiz edildiğinde normal olarak
belirlendiğini gösteren kanıtlar mevcuttur.

İleri maternal yaş nedeniyle uygulanan PGS’den
alınan sonuçlar değişkendir.

Tekrarlayan gebelik kaybı görülen dengeli
translokasyon taşıyıcıları da PGS’den
yararlanabilmektedir.

SART (Society of Assisted Reproductive
Technology) and ASRM (American Society of
Reproductive Medicine) mevcut yayınların, PGS
ile ileri yaş gebeliği, tekrarlayan gebelik kaybı ve
implantasyon başarısızlığında canlı doğum
şansını yükseldiğini desteklemediğini
belirtmişlerdir ve PGS sonuçlarına dayanarak
tedavi seçeneğinin belirlenmesini tavsiye
etmemektedir.

PGD veya PGS ile birlikte uygulanan IVF işlemi
neticesinde doğan bebeklerde fetal
malformasyon ve diğer problemlerde artış
olduğunu gösteren bir yayına rastlanmamaktadır.

Ancak yaşamın ilerleyen dönemlerinde PGD
veya PGS prosedürünün (biyopsi) bir sonucu
olarak diğer anomalilerin görülmesi olasılığı
bulunmaktadır.

PGD veya PGS ile birlikte uygulanan IVF işlemi
için başvuru oranı, transfer edilen embriyo
sayısının azalması nedeniyle PGD ve PGS
olmadan uygulanan IVF başvuru oranına göre
daha düşüktür.
AVANTAJLAR

Gebeliğin geç dönemlerinde, abortus veya gebeliği
sonlandırma gibi zor bir seçimle karşılaşma durumunu
ortadan kaldırır.

Genetik bir hastalığın taşıyıcısı olduğunu bilen ve çocuk
sahibi olmayı düşünmeyen çiftler için yeni bir umuttur.

Günümüze kadar, PGD veya PGS ile çok sayıda bebek
dünyaya gelmiş ve fetal malformasyon veya diğer
tanımlanabilir problemlerde bir artış görülmemiştir.
GELECEKTE

İnsanda ilk başarılı PGD denemesi 1988’de uygulanmıştır, ancak
yöntemin gelişmesi ve kabul görmesi, tek hücre biyopsisinin
geliştirilmesinin zaman alması ve maliyeti nedeniyle yavaş
olmuştur.

PGD yeni bir uygulamadır ve hala yöntemin gelişmesi için birçok
çalışma devam etmektedir. Fakat PGD’nin kapsamlı, kabul gören
ve yaygın uygulanan bir yöntem olması için çok daha fazla
çalışmaya ihtiyaç duyulmaktadır.

PGD veya PGS uygulamalarının sınırlandırılmasının gerekliliği
önemle vurgulanmaktadır.

Gelecekte, diabet, hipertansiyon, kardiyovasküler hastalıklar,
endometriyum kanseri gibi hastalıkların genetik ilişkisi daha iyi
anlaşılacaktır. PGD uygulamalarıyla bu hastalıkların kalıtımının
önlenmesi mümkün olacaktır.

PGS’nin IVF için başvuran hastalara uygulanması hala tartışılan
bir durum olsa da önemi, sağladığı fayda ve sonuçları nedeniyle
üreme teknolojisinde hala çekici bir yöntemdir.

Bunun yanı sıra, belki de gelecekte PGS ile ilgili daha çok
tartışma ve etik kaygı gündeme gelebilecektir
KAYNAKLAR




Dayal MB, Zarek SM. Preimplantation genetic diagnosis. 2008
Black, S.H. Preimplantation genetic diagnosis. Current Opinions in
Pediatrics 1994: 6, 712-716.
Harper, J.C., Handyside A.H. The current status of
preimplantation genetic diagnosis. Curr Obstet Gynecol 1994: 4,
143-149.
Schulman JH, Black SH. Preimplantation Genetic Testing for
Huntington Disease and Certain Other Dominantly İnherited
Disorders. Clinical Genetics 1996