Transcript Document 7557337

Cultivos Celulares
Métodos y Técnicas de Estudio en Biología Celular
Objetivos
Puntos que deben ser asimilados
1.
2.
3.
4.
5.
6.
-Equipo básico de un laboratorio de cultivo celular
-Cultivos primarios y líneas estables
-Preparación del medio de cultivo
-Asepsia en el cuarto de cultivo y esterilidad
-Rutina en el mantenimiento de la línea celular estable
-Congelación y almacenamiento de las líneas celulares
Equipo Básico de un laboratorio de Cultivo
Celular
1. Campana de flujo laminar
2. Baño termostatizado
3. Incubador CO2
4. Autoclave
5. Nevera y Congelador
6. Microscopio Invertido
7. Micro centrifuga
8. Depósito de Nitrógeno líquido
Autoclave
Cualquier recipiente, herramienta... Debe ser esterilizada
Tanque de Nitrógeno líquido
Congelación de líneas estables
Campana de Flujo Laminar
Esterilidad!! (no evita contaminación un mal uso)
Incubador CO2
Atmósfera controlada con elevada humedad y tensión de CO2
Micro Centrifuga
Suspensiones celulares (lavados, concentrados, subcultivos)
Microscopio Invertido
Seguimiento del cultivo: viabilidad,
multiplicación, contaminación.
Control sobre cambios morfológicos
(efectos de hormonas, de tratamientos
con medicamentos, de iones,
interacciones, etc.
Botellas y Placas de Cultivo
Puntos Importantes
Esterilidad
Asepsia
Hábito
de trabajo
Cultivos Primarios
(El principio de la historia.....)
A- Aislamiento del tejido
B- Disección/disgregación
C- Cultivo celular en recipiente
(Placa Petri) (Cultivo primario)
Aunque potencialmente se puede obtener un cultivo primario a partir
de cualquier tipo de tejido, normalmente los tejidos embrionarios y
tumorales dan los mejores resultados, debido a que su grado de
diferenciación es menor y su capacidad de división mayor.
Preparación cultivos
Cultivos secundarios y líneas
estables
1.
2.
3.
Si uno o varios tipos de células de un cultivo
primario se re-siembran (sub-cultivo), el cultivo
obtenido se denomina cultivo secundario.
La heterogeneidad celular es menor: el medio
utilizado determinará qué células se desarrollarán.
Las líneas estables son las que se obtienen por subcultivo y selección de cultivos secundarios.
También se pueden obtener a partir de tejidos
tumorales.
Selección de la línea estable
Líneas celulares estables
Ventajas
Desventajas

Control del entorno celular

Falta de diferenciación

Homogeneidad celular

Inestabilidad de la línea
(mutaciones DNA)

Conocimiento del tipo celular

Economía
Medios de Cultivo: Medios Base
Medios base: Eagle’s Basal Medium,
Dulbecco’s modified Eagle’s medium
(DMEM), RPMI1640, etc.
Contienen: Hidratos de Carbono, ácidos grasos
esenciales y otros lípidos, aminoácidos, sales
minerales, oligoelementos.
*Cada línea celular tiene unos requerimientos que hacen que
crezca mejor en un determinado tipo de medio
Medios de Cultivo: Aditivos

Antibióticos: estreptomicina (Gram +/-),
penicilina (Gram +), amfotericina (levaduras y
hongos)
 Tampón pH: Hepes, bicarbonato, etc.
 Indicador pH.
 Suero fetal: Bovino, ovino, humano. 10% (250%).
 Aditivos específicos: Suplemento de piruvato,
suplemento de glucosa, etc.
Tamponadores de pH

Hepes
Buffer tamponador que actúa de manera muy
eficiente en el rango 7,2-7,6
*Importancia de la ppCO2 en el mantenimiento del pH
H2O + CO2  H2CO3  H+ + HCO3*
Rojo Fenol (Phenol Red-Na) (Indicador de pH)
Propiedades físico-químicos
del Medio
CO2: Normalmente 5% (2-8% depende de tipo celular y [HCO3-]
pH.............................................................(7.0-7.7)
Osmolaridad.............................................(290-320) mOsm/Kg
Viscosidad................................................ Suero
Temperatura............................................. 37ºC (mamífero)
(aves: 38,5ºC; epitelio de ratón: 33ºC; insectos: 28ºC)
Test de medio completo con
suero

Previamente a la realización de
experimentos los medios deben ser
probados a diferentes niveles.
1.
Posible Contaminación
Niveles de Proliferación Celular
(eficiencia)
2.
Elección del medio de cultivo
adecuado a cada línea celular

Se deben realizar diferentes pruebas con
varios medios de cultivo en la elección del
medio más adecuado a las características de
nuestra línea.

Las pruebas consisten en la realización de
diferentes curvas de crecimiento
Conceptos básicos en el
mantenimiento de una línea estable
 Subcultivo
 Confluencia
 Tiempo
de duplicación
 Criogenización
 Ciclo celular: Fases G1,S,G2,M y G0
¿Qué son y cómo se realizan
los subcultivos?
Objetivos:
i. Propagación de la línea celular
ii. Producción de células para la experimentación
Usualmente se realizan al llegar a confluencia.
Evitar que el medio de cultivo esté agotado.
Curva de Crecimiento (líneas
estables): Fases del cultivo
•Fase de latencia (período lag). Fijación al sustrato e
inicio del ciclo celular.
•Fase de crecimiento exponencial. El número de células
se duplica aproximadamente cada 24 horas.
•Fase de confluencia. Las células del cultivo, que se ha
saturado, dejan de dividirse (monocapa: inhibición por
contacto; suspensión: consumo del medio).
•Fase de muerte. Si el cultivo se prolonga por demasiado
tiempo, las células entran en una fase de senescencia que
termina con la muerte de las células en cultivo.
Subcultivos Celulares
Protocolo Subcultivo
Depende de las características de la línea
celular con la que se esta trabajando.
1.
2.
Células en suspensión
Células adheridas al substrato
Células Adheridas
Para realizar el subcultivo de células adheridas se
debe proceder al levantamiento de las mismas:
Tripsinización.
Levantamiento Mecánico (raspado).
En células en suspensión es suficiente con realizar una
dilución en medio nuevo (o bien adición de medio tras
centrifugación).
La Fase Experimental
Objetivos:
Investigación de un fenómeno biológico
ii. Estudio de las bases moleculares de una patología
iii. Investigación de los mecanismos empleados por los
fármacos
iv. Estudio de la toxicidad de determinados compuestos
v. Investigación de la estructura y función de
macromoléculas y orgánulos celulares
i.
La Fase Experimental
Planteamiento:
Se cultivan en frascos separados las células control y las células
“problema”. Se adiciona un compuesto o se cambian las
condiciones experimentales del frasco problema y se
mantiene la incubación durante un tiempo (minutos a días).
Finalmente se determinan las diferencias entre las células
tratadas (problema) y las no tratadas (control).
En determinadas ocasiones no se realiza un tratamiento en
paralelo de células en diferentes frascos, sino un tratamiento
secuencial de las células control (antes y después de ciertas
condiciones).
La Fase Experimental
Investigación:
Es la fase en la que utilizando una técnica experimental
determinamos algún fenómeno celular. Podemos
estudiar el efecto de una hormona sobre la localización
de proteínas celulares mediante microscopia confocal
(células vivas), podemos determinar mediante RT-PCR o
western blot la expresión de un determinado gen o hacer
un estudio completo de la expresión génica mediante
proteómica y/o genómica (células muertas).
La Fase Experimental
Transfección: Introducción de DNA externo con un
vector de expresión.
TIPOS: Transitoria o estable.
MÉTODOS:
Electroporación
Fosfato cálcico
Lipofección
Microinyección