Transcript Enzymologia I Zakład Regulacji Metabolizmu Instytut Biochemii Uniwersytet Warszawski Sporządzanie roztworów kurs praktyczny.

Enzymologia I
Zakład Regulacji Metabolizmu
Instytut Biochemii Uniwersytet Warszawski
Sporządzanie roztworów
kurs praktyczny
Roztwory procentowe
C% (wag/wag)
Ilość gramów substancji w 100 gramach roztworu
C% (wag/obj)
Ilość gramów substancji w 100 ml roztworu
Roztwory molowe
Ilość moli, mmoli, moli, nmoli określonej substancji
w 1 dcm3 (litrze) roztworu
mM = mmole w 1 litrze
M = mole w 1 litrze
Stężenie substancji
mmole, mole
Ilość substancji
C% (w/w) = X gramów w 100 gramach
roztworu
d = masa 1 ml roztworu
1000d = masa 1 dcm3 roztworu
X — 100 g
Y — 1000d
Y/Mmol = ilość moli w 1 dcm3
C (w/v) % = X gramów w 100 ml
roztworu
10X = ilość gramów w 1dcm3
10X/Mmol = ilość moli w 1dcm3
Cmol = X
X mmoli —1000 ml
Y mmoli — z ml
Sporzadzanie mieszanin;
roztworów zawierających wiele składników w tej
samej objętości
Stężenia poszczególnych substancji (mM, M, nM, %)
są wyrażane niezależnie
Rozcieńczanie roztworów
Vkońcowa/Vpoczątkowa = n (rozcieńczenie roztworu)
Cpoczątkowe / n = Ckońcowe
Cpoczątkowe/Ckońcowe = m
m - ile razy należy rozcieńczyć roztwór wyjściowy
Przykładowe obliczenia
Stężenie procentowe
Obliczyć C % (wag./wag.)
12 M HCl ? d = 1,19 g/cm3 (ml) Mcz HCl = 36,5
Obliczyć C % (wag./obj.)
15% roztwór molibdenianu sodu, 15% (wag./obj.) roztwór azotynu sodu
0,02% roztwór NaN 3 (2 ml), 0,9% roztwór NaCl (50 ml)
naważka NADH służąca do sporządzenia roztworu o stężeniu 10 mg /ml (250 l)
Standardowy odczynnik erytrozyny B, 30 mg/ml (0,5 ml)
Stężenie molowe
Obliczyć zawartość substancji w (,m)molach, stężenie (,m)M ostatecznego roztworu
100 mM wodny roztwór NAD+ (350 l), 1 M wodny roztwór etanolu (200 l)
2 M NaOH (35 ml), 2 M HCl (30 ml), 10 mM roztwór wzorcowy L-DOPA (5 ml)
2,5 mM tyrozyna (40 ml)
2 M roztwór L-alaniny (10 ml)
0,2 M 2-oksoglutaran sodowy lub 0,2 M kwas 2-oksoglutarowy zobojętniony NaOH lub KOH
(500 l)
0,5 M roztwór Na2CO3 (2 ml), 1 M roztwór NaCl (10 ml), 0,1 M bufor Tris-HCl pH 7,5 (25 ml)
0,1 M roztwór pirogronianu sodu (1 ml)
Mieszanie i rozcieńczanie roztworów
Jakie będzie końcowe stężenie % lub molowe; ile razy trzeba rozcieńczyć roztwór
20 ml 15% (wag./obj.) roztwór molibdenianu sodu zmieszanego z 20 ml 15% (wag./obj.) azotynu
sodu (NaNO2) (40 ml)
Odczynnik Bradford. 100 mg Coomassie Blue G-250 rozpuścić w 50 ml 96% etanolu. Do tego
roztworu dodać 100 ml 85% (wag./obj.) kwasu ortofosforowego. Otrzymany roztwór rozcieńczyć
wodą destylowaną do objętości końcowej 1 l
Wyjściowe: 0,4 M bufor fosforanowy, pH 7,4 (10 ml) i 2 M roztwór L-alaniny (10 ml)
Końcowe: 0,2 M bufor fosforanowy + 0,2 M L-alanina (20 ml)
Mieszanina reakcyjna zawierająca 40 mM bufor Tris-HCl pH 7,4, 25 mM KCl, 6 mM EGTA
(25 ml roztworu)
0,1 M bufor Tris-HCl pH 7,5 zawierający 1 M KCl (25 ml)
100 ml 25 mM buforu cytrynianowego, pH = 3,0. Rozcieńczyć przygotowany 0,1 M bufor
cytrynianowy
Roztwór erytrozyny B – przyrządzić bezpośrednio przed użyciem. 0,1 ml standardowego
odczynnika erytrozyny B (30 mg/ml) odmierzyć do kolby miarowej na 100 ml i uzupełnić do kreski
25 mM buforem cytrynianowym pH 3,0
Przeliczanie wartości
absorbancji
Redukcja NAD+ w reakcji katalizowanej
przez dehydrogenazę mleczanową
CH 3
*
H) C) OH + NAD
*
COOH
+

amid kwasu
nikotynowego
CH 3
*
NADH + H
+
absorbancja 340 nm
+ C4 O
*
CO OH
220 nm
260 nm
340 nm
NADH
NAD +
200
250
300
350
Długość fali [nm]
400
450
Pomiary spektrofotometryczne w badaniach enzymatycznych
CH3
*
H) C) OH + NAD+
*
COOH

CH3
*
NADH + H+
+ C4 O
*
COOH
340 n m
Redukcja NAD+ w reakcji katalizowanej
przez dehydrogenazę mleczanową
prowadzi do wzrostu absorbancji
Utlenienie NADH w reakcji katalizowanej
przez dehydrogenazę mleczanową
prowadzi do spadku absorbancji
Czas [m in]
A=
lC  = 6,22 mM-1 cm-1
C = A/
l
NADH
Stosując prawo Lamberta-Beera otrzymaną wartość absorbancji
przeliczamy na stężenie substancji
3
mM = mmole w 1 dcm
stężenie [mM] odpowiada ilości mmoli w 1 dcm 3
należy wyliczyć ile mmoli substancji znajduje się w kuwecie
pomiarowej (np. w 2ml)
wyliczona liczna mmoli odpowiada ilości substancji w mmolach
dodanej do kuwety
1 ml wyjściowego roztworu NADH
10 mg ml-1
20 l
Całkowita objętość roztworu w kuwecie = 2 ml
= 340 nm
Absorbancja = 0,875
CM i zawartość NADH w kuwecie
CM i zawartość NADH w roztworze wyjściowym
-1
-1

NADH = 6,22 mM cm
Mcz NADH-Na2 = 709,42
Stężenia roztworów w kuwecie
Do kuwet o pojemności 2 ml odmierzyć po 1 ml mieszaniny reakcyjnej, 5 l
rotenonu i 10 lub 20 l NADH (10 mg/ml) oraz 10 l frakcji cytosolowej wątroby i
wodę w takiej objętości, by w chwili rozpoczęcia reakcji po dodaniu 40 l
pirogronianu całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 2 ml
Mcz NADH-Na2 = 709,42
-1
-1

NADH = 6,22 mM cm
Obliczyć stężenie mmolowe i zawartość NADH w kuwecie
NADH 10 mg/ml
Absorbancja
Ilość próby
20 l
10 l
0,875
0,438
[C] mmolowe
mM
mM
Zawartość NADH w kuwecie
moli
moli
Krzywa wzorcowa do oznaczania białka z zastosowaniem Erytrozyny B
0.7
Próba odniesienia
150 l H2O
2,85 ml roztworu Erytrozyny B
0.6
0.5
0.4
Próby wzorcowe
0.3
2,85 ml roztworu Erytrozyny B
+
0.2
5 g białka w 150 l H2 O
0.1
10 g białka w 150 l H2 O
0
0
5
10
15
20
Zawartość białka [g]
25
30
15 g białka w 150 l H2 O
Próby badane: 2,85 ml roztworu Erytrozyny B
+
60 l próby X + 90 l H2 O
60 l próby Y + 90 l H2 O
20 g białka w 150 l H2 O
25 g białka w 150 l H2 O
Krzywa wzorcowa
Jakie będzie molowe stężenie końcowe, ile razy rozcieńczono roztwory wyjściowe, ile substancji
znajduje się w kuwecie
Nr probówki
0
1
2
3
4
5
6
10 mM L-DOPA
l roztworu
0
20
40
60
80
100
120
Mieszanina
reakcyjna
500
480
460
440
420
400
380
Absorbancja
460 nm
0
0,13
0,25
0,39
0,51
0,61
0,71
Roztwory
dodać do każdej probówki: 500 l 2 M HCl oraz 1000 l mieszaniny 15% molibdenianu sodu
z 15% azotynem sodu, 1000 l 2 M NaOH
Jaka jest zawartość L-DOPA w 10 ml próbkach w których przeprowadzono reakcję
enzymatyczną, jeśli pomiar wykonano tak samo jak dla krzywej wzorcowej, pobierając do
oznaczeń z probek po 20 l roztworu i stwierdzając, że wartość absorbancji wyniosła w
kolejnych próbkach: 0,31; 0,38; 0,68; 0,12; 0,05 ?
Wyznaczanie wartości
szybkości reakcji
V początkowa reakcji enzymatycznej
Abs = 0,132 min -1
0
 CNADH = 0,0212 mM min -1 = 21,2 M min -1
-0 ,0 6
 zawartości NADH w kuwecie (2 ml) w ciągu 1 min
42,4 nmola min -1
-0 ,1 2
= aktywności tej objętości preparatu
enzymatycznego którą dodano do
kuwety
-0 ,1 8
-0 ,2 4
-0 ,3 0
0 ,0
1 ,0
2 ,0
Czas [min]
3 ,0
4 ,0
Vw kuwecie = aktywność w kuwecie =  zawartości NADH min-1 [ mol min-1 ]
do kuwety dodano określona ilość [x l] preparatu enzymatycznego z wyjściowego
roztworu preparatu enzymatycznego, którego objętość całkowita wynosiła jest
odpowiednio większa, np. 100 razy [y l]
Całkowita aktywność preparatu enzymatycznego
x — Vw kuwecie
y — Vcałkowita
Vcałkowita = y · Vw kuwecie / x [mole min-1]
Stwierdzono, że w wyjściowym preparacie enzymatycznym o objętości y [l ]
znajduje się z mg białka [mg]
Aktywność właściwa preparatu enzymatycznego
Aktywność całkowita preparatu enzymatycznego/ całkowitą zawartość białka w
preparacie enzymatycznym
[mole min-1 / mg białka]
-1
-1

NADH = 6,22 mM cm
1 ml wyjściowego roztworu preparatu
enzymatycznego
20 l
Całkowita objętość roztworu w kuwecie = 2 ml
Zmiany absorbancji w czasie:
= 340 nm
sekundy
0
15
absorbancja
0
0,12
30
45
0,24
60
0,36
0,48
Zmiany absorbancji w czasie 1 minuty, wyznaczone z odcinka prostoliniowego
Zmiany stężenia w czasie 1 minuty
Zmiany zawartość NADH w kuwecie w czasie 1 minuty = szybkość reakcji
= aktywność 20 l preparatu enzymatycznego
Zmiany zawartość NADH w wyjściowym roztworze preparatu enzymatycznego
w czasie 1 minuty = całkowita aktywność preparatu enzymatycznego
1 ml wyjściowego roztworu preparatu
enzymatycznego
20 l
Objętość roztworu w próbie w której
przeprowadzono reakcję z erytrozyną = 3 ml
Pomiar absorbancji
produktów reakcji
barwnej
Pomiar absorbancji = 0,4
= 545 nm
0.7
Zawartość białka w kuwecie
= zawartość białka w 20 l preparatu
0.6
0.5
0.4
Zawartość białka w 1 ml
wyjściowego preparatu
enzymatycznego
0.3
0.2
0.1
0
0
5
10
15
20
Zawartość białka [ g]
25
30
-1
-1

NADH = 6,22 mM cm
Mcz NADH-Na2 = 709,42
Szybkość początkowa, aktywność właściwa
W analogiczny sposób oznaczać aktywność enzymu w kolejnych frakcjach eluatu z kolumny,
odmierzając 50–200 l eluatu otrzymanego po przepuszczeniu przez kolumnę frakcji cytosolowej
Ilość próby
50 l z 1,5 ml
100 l z 1,5 ml
Absorbancji/min
0,0622
0,2488
[C] mmolowe/min
mM /min
mM/ min
 zawartości NADH
w kuwecie/min
mole/min
mole/min
 zawartości
NADH wpreparacie
wyjściowym/min
mole/min
mole/min
Do pozostałych probówek odmierzyć po 60 l 10-krotnie rozcieńczonego cytosolu lub
nierozcieńczonych eluatów. Następnie do tych próbówek odmierzyć po 90 l wody i po 2,85 ml
roztworu erytrozyny B
Ilość próby
60 l z 1.5 ml
60 l z 1.5 ml
Absorbancja
0,300
0,600
Zawartość białka w kuwecie
g
g
Zawartość białka w preparacie wyjściowym
mg
mg