Transcript Production de biohydrogène par fermentation anaérobie chimiotrophe de substrats carbohydratés S. Hiligsmann 8 juin 2012 Dissertation originale présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur.

Production de biohydrogène par
fermentation anaérobie chimiotrophe
de substrats carbohydratés
S. Hiligsmann
8 juin 2012
Dissertation originale présentée en vue de l’obtention
du grade de Docteur en Sciences de l’ingénieur
1
Introduction
• Contexte socio-économique : résidus organiques, production d’hydrogène
• Production d’hydrogène par “dark fermentation”
Objectifs et stratégie
Résultats
• Sélection des souches
• Etude et optimisation des conditions de culture
• Etude des bioréacteurs
• Intégration dans la digestion anaérobie (biométhanisation)
Discussion générale- perspectives
Conclusions
2
Contexte socio-économique
– Déchets fermentescibles : > 1 kg/hab/j
• Mat. Org. des ménages, industries, eaux usées, …
• 2010  50% : valorisation énergétique  seule opportunité
– Besoins énergétiques : > 14 kg ‘pétrole’/hab/j (~160 kWh)
• Grande dépendance aux combustibles fossiles
• Emissions de gaz à effet de serre – réchauffement climatique
• directive euro. 2009  13% énergies vertes/renouvelables en 2020
 exploitation de tous les moyens de production d’énergie
(solaire, éolien, biomasse, …)
 réduction de la consommation d’énergie
(transport, isolation, …)
Ville moyenne ~ Liège : 100 t/j déchets à valoriser
 Potentiel équivalent à une éolienne 24h/24
3
Production d’hydrogène
CO + H2O  CO2 + H2
– Oxydation partielle des hydrocarbures
– Gazéification du charbon/biomasse (%MS>>)
CaHbOg + O2 + H2O  CO2 + H2
– Electrolyse de l’eau
H2O +
(500 109 Nm³/year)
CH4 + H2O  CO + 3H2
95 % H2 - production industrielle
– Reformage du méthane (800 °C)
 ½ O2 + H2
– Production par voie microbiologique
4
Voie microbiologique de production d’H2
Clostridium, Ruminococcus, Aeromonas, Bacillus,
Escherichia, Citrobacter, Chlorobium, Rhodospirullum,
Chromatium, Chlamydomonas, ...
Microorganismes :
• Bactéries
• Algues
 phototrophes
 chimiotrophes
5
Source Lumière Anaérobiose,
carbonée
Nutriments
C6H12O6
Source
carbonée
C6H12O6
Microorganismes
phototrophes
Microorganismes
chimiotrophes
Dark fermentation
CO2 + H2
...  6CO2 + 12H2
Rendement élevé
Alcools, acides, ...
en solution aqueuse
...  2CH3COOH + 2CO2 + 4H2
Productivité élevée
6
Processus de biodégradation
digestion anaérobie
MATIERE ORGANIQUE
COMPLEXE
Hydrolyse
cellulases, amylases
proteases, lipases, …
Acidogenèse
COMPOSES ORGANIQUES SOLUBLES
(Carbohydrates, acides aminés, ac. gras)
Bacillus,
Enterobactéria, …
ACIDES GRAS VOLATILS
ALCOOLS
Etage 1
Acétogenèse
Clostridium,
Ruminococcus, …
CO2 ,H2
AC. ACETIQUE
Méthanogenèse
Methanobacter,
Methanosarcina, …
CH4
CO2
Etage 2
7
Question 1 : intérêt de scinder la
digestion anaérobie  H2 + CH4
 Améliorer le procédé de DA / intégration dans ind. agro-alim.
• Résistance aux chocs d’alimentation (initié par : Pohland 1971)
• Production rapide de fuel (acidogenèse plus rapide que methanogenèse)
• Rendements énergétiques plus élevés 10-30% selon substrat, process
 Avantages de l’hydrogène
• Densité d’énergie : DEH2 = 33 kWh/kg H2 = 2.4 DECH4
• Combustion : H2+ ½ O2  H2O
CO2 = Ø
• Potentialités des piles à combustible : PC >  moteur
8
Question 2 : faisabilité d’optimisation
de la production d’H2 par dark fermentation
 Etat de l’art
• essentiellement développé à partir de populations mixtes
• souches Clostridium plus performantes
• pH acide favorable
• H2  effet rétro-inhibiteur
 Besoins scientifiques et technologiques
• comparer les souches et populations mixtes
• maîtriser le métabolisme  rendement élevé en H2
• comparer les bioréacteurs  application industrielle
9
Objectifs et stratégie
1. Screening dans des conditions standardisées
• souches pures et populations mixtes
• fioles à pH libre et bioréacteurs à pH régulé
2. Etude et optimisation des souches retenues
• détermination du pH optimal pour la production d’H2
• étude des métabolites solubles  optimisation
3. Etude de bioréacteurs à forte concentration cellulaire
• bioréacteurs séquentiels à cellules en suspension
• bioréacteurs à cellules immobilisées
et haut potentiel de transfert gazeux
10
Résultats 1 : screening des souches
1. Screening général en fioles - conditions standardisées
• 13 souches pures
- 2 anaérobies facultatives :E. coli ATCC10536 et Citrob. freundii CWBI952
- 11 anaérobies strictes : Clostridium spp. DSMZ et C. but. CWBI1009
- 2 souches thermophiles (55°C)
H2 +++; Amidon + (Cf litt.)
- 3 souches de l’espèce C. butyricum
• 6 populations mixtes de bioréacteurs de digestion anaérobie
- bioréacteur à cuve agitée ou de type UASB (upflow anaerobic sludge blanket)
- 4 populations traitées thermiquement (80°C 10/30 min)
 isoler les microorganismes sporulants dont les Clostridium
11
Résultats 1 : screening des souches
1. Screening général en fioles - conditions standardisées
• conditions de culture robustes,
larges et contraignantes
- pH acide ( pH = 3 unités)
- surpression (P = 2 bar)
 perspectives d’applications industrielles
 méthodologies originales
(analyses métabolites solubles – gazeux)
12
Résultats 1.1. : screening en fioles
B
Suivi de la production d’H2 en fonction du temps d’incubation
L1
C
L2
L1
13
Résultats 1.1. : screening en fioles
Comparaison des rendements de production d’H2
Rendement d'H2 (mol H2/mol glucose)
1,40
1,20
1,04
1,02
1,04
0,96
1,00
0,95
0,80
0,69
0,68
0,60
0,40
0,20
0,00
C. but.
CWBI
CSAD
CSAD 10' CSAD 30'
80°C
80°C
UASB
UASB 10' UASB 30'
80°C
80°C
 Performances supérieures pour les souches traitées
thermiquement et C. butyricum CWBI1009
14
Résultats 1.1. : screening en fioles
Rendement d'H2 (mol H2/mol glucose)
Comparaison des rendements de production d’H2
1,80
1,60
Anaérobies strictes
facultative
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
performances variables : - Clostridium
> anaérobies facultatives
- C. butyricum > autres Clostridium spp.
> souches thermophiles
15
Résultats 1 : screening des souches
2. Comparaison des souches retenues en bioréacteurs
 confirmation de l’intérêt du screening et des performances
des souches retenues en conditions régulées
- pression atmosphérique
 suivi régulier du volume cumulé d’H2
- pH régulé
 pH optimum
bioréacteur de 2,3 L
- 1 souche anaérobie facultative
Citrob. freundii CWBI952
- 1 souche anaérobie stricte
 C butyricum CWBI1009
- 1 population mixte
 UASB 80°C / 30 min
16
Résultats 1.2. : screening en bioréacteur
Suivi de la production d’H2 en fonction du temps d’incubation
C.35but. CWBI1009
180
30
160
Concentration (mM)
25
140
120
20
100
15
80
60
10
40
5
20
0
Volume d'hydrogène par gramme de glucose
(mL
d’H2
Rendement
gluc.)
consommé
(ml
H2/gH2/g
glucose)
200
0
0
5
10
15
20
25
Temps (heure)
Glucose
Succinate
Lactate
Formiate
Acétate
Ethanol
Butyrate
Hydrogène
 H2, acides et éthanol = métabolites primaires
17
Résultats 1.2. : screening en bioréacteur
Comparaison des rendement et productivité d’H2
300
250
rendement H2 (mL/g gluc.)
débit H2 (mL/L.h)
200
150
100
50
0
batch
SBR
Cit. freundii
C. but.
batch
SBR
C. butyricum
batch
SBR
UASB 80°C / 30 min
 rendement et productivité 3 et 4 fois > Citrob. freundii
 rendement 80 % > population mixte
18
Résultats 1 : screening des souches
 intérêt d’un screening large et original des souches
 déjà pertinent en fioles microcosmes
 la microbiologie apporte une plus-value dans l’optimisation
Facteur 3 à 4 d’amélioration des rendements et productivités
 performances les plus élevées et les plus stables atteintes par
C. butyricum
Optimisation des conditions de culture
des souches retenues
19
Résultats 2 : optimisation
1. Effet du pH sur la production d’H2
 pH optimum
• Citrobacter freundii CWBI952
• Clostridium butyricum CWBI1009
substrat glucose
substrat amidon

5,9


5,2
5,6
2. Etude des métabolites solubles : acides et éthanol
 bilan de matière = quantité de carbone issu du substrat G
et converti en métabolite i
C6H12O6  2CH3COOH + 2CO2 + 4H2
𝑁 .∆𝐶
𝑀𝐵 = 𝑖 𝑖
(1)
6C
+ 2 CCO2 + Ø C
𝑁𝐺 .∆𝐶𝐺
G  4 CAcetate
100% CG  66,7%
+ 33,3%
20
Résultats 2.1. : effet du pH
Rendements de production d’H2 et autres métabolites
glucose consommé (ml H2/g glucose)
Volume d'hydrogène
gramme de
d’H2 (mLproduit
Rendement
H2/gpar
gluc.)
200
150
100
y = -56,004x4 + 1386,5x3 - 12756x2 + 51608x - 77225
50
2
R = 0,9951
0
4
4,5
5
5,5
6
pH
pH 5,2
6,5
7
7,5
Carbone initial converti en métabolites (%)
Butyrate
250
Ethanol
Acétate
Formiate
Lactate
 optimum pour production H2
 butyrate >> et formiate << pH [6-7,5]
21
Résultats 2.2. : orientation métabolique
Culture en mode séquentiel (SBR) : analyse du bilan carboné
Carbone initial converti en métabolites (%)
80
Butyrate
70
Ethanol
60
Acétate
Formiate
50
Lactate
40
30
20
10
0
2,3L batch - pH 5,2
2,3L SBR - pH 5,2
Renouvellement 40% du milieu  butyrate et acétate essentiellement
 rendement d’H2 + 35%
 Orientation du métabolisme vers les voies productrices d’hydrogène
22
Résultats 2 : Optimisation
 pH optimum pour la production d’H2 dépend de la souche et
du substrat (glucose/amidon)
 en bioconversion, le microorganisme oriente son métabolisme
C6H12O6 + 2 H2O → 2 CH3COOH + 4 H2 + 2 CO2
C6H12O6 → CH3CH2CH2COOH + 2 H2 + 2 CO2
 maîtrise de la culture pure de la souche anaérobie stricte
Optimisation du bioréacteur pour maximiser
les rendements de production d’hydrogène
avec la souche retenue C. butyricum
23
Résultats 3 : Etude des bioréacteurs
1. Bioréacteur batch et séquentiel à cuve agitée
• technologie simple, robuste
• absence d’agitation
• productivité limitée




283 mL H2 / g glucose
perte 47% de rendement
formation de flocs cellulaires
~ 100 L H2 / m³milieu . h
effet rétro-inhibiteur de l’H2 produit ?
H2 bact.
H2 en
solution
Impact du transfert L/G de la molécule
connu par la biochimie
souvent évoqué pour expliquer les limitations
mais peu souvent quantifié
car lié à la pression partielle en H2 (PH2)
H2
gazeux
24
Résultats 3.2. : effet de PH2
PH2 < 60 Pa
4 H2 +
2 acetate
PH2 > 60 Pa
Angenent (2004)
2 H2 +
1 butyrate
25
Résultats 3.2. : effet de PH2
30
25
140
200
160200
25
25
20
100
15
15
150
120150
20
20
15
80 100
60
10
10
10
100
Concentration (mM)
Concentration
(mM)
Volume d'hydrogène par gramme de glucose
consommé
(ml H2/g
ml H2/g glucose
ml H2/h
- glucose)
35
180
30
30
250
200250
35
35
5
0
0
0
0
000
Glucose
55
10 10
15 15
15
10
Temps
Time
(h)
(heure)
Temps(heure)
5
Succinate
Lactate
Formiate
Glucose
Acétate
Hydrogène
20
20
Ethanol
20
Butyrate
25
25
0
0
20
5
5
50
40 50
25
Hydrogène
 tester des bioréacteurs avec transfert L/G amélioré
26
Résultats 3.2. : effet de PH2
Etude de la production d’H2 en bioréacteur à « biodisque »
• surface d’échange L/G élevée
• rétention cellulaire
• homogénéisation  conditions environnementales maîtrisables
 prélèvement d’échantillons représentatifs
• peu énergivore
Biogas outlet
Medium addition
Medium removal
27
Résultats 3.2. : effet de PH2
Productivité
Productivité d'H2 (ml/L.h)
300 mL
500 mL milieu de
culture
750
310
290
650
270
550
250
450
230
350
210
250
190
150
170
50
150
0,2
0,7
1,2
1,7
2,2
2,7
Rendement d'H2 (mL/g glucose)
850
Rendement
3,2
Charge organique (g glucose / L . h)
500 mL  300 mL vol. liquide  rendement d’H2 + 30%
 > 300 mL H2 / g glucose consommé
28
Résultats 3 : Bioréacteurs
 bioréacteur séquentiel simple, robuste mais limitant
 mise en évidence de la formation de flocs/biofilms par la
souche pure  potentialités de rétention cellulaire
 impact crucial du transfert L/G
 maîtrise de culture pure anaérobie stricte en bioréacteur avec
volume gazeux majoritaire
Etude des potentialités de biodégradation
des métabolites  biométhanisation
29
Résultats 4 : 2e étage  CH4
Effluents biohydrogène  bioréacteur séquentiel 20L
50
3,50
Cumulative biogas production
Biogas production rate
45
3,00
2,50
35
30
2,00
25
1,50
20
15
1,00
10
0,50
5
0
Biogas production rate (l/d)
Cumulative biogas production (l)
40
0,00
0
10
20
30
40
Time (d)
50
60
70
80
 méthanogenèse efficace :170 mL CH4 /g DCO
30
Discussion générale
1. Amélioration significative des performances
Biogas outlet
Medium addition
Medium removal
31
Discussion générale - perspectives
2. Résultats pertinents et originaux
AnBDR
V Ginkel 2005
Chu et al 2011 - H/D = 3,2
Amorim et al 2009 - H/D = 36
450
HFBR
Chu et al 2011 - SS
Chu et al 2011 - H/D = 9,1
Max
Rendement d'H2 (ml/g glucose consommé)
400
350
C6H12O6  2,4 H2 + CO2 + 0,9 Acétate + 0,6 Butyrate
300
250
200
150
100
50
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Charge organique (g glucose / L . h)
Charge organique > 3 g/L.h  perte de rendement d’H2
32
AnBDR
Jo et al 2008
Chu et al 2011 - SS
Chu et al 2011 - H/D = 9,1
Max
2500
HFBR
V Ginkel 2005
Chu et al 2011 - H/D = 3,2
Amorim et al 2009 - H/D = 36
Productivité d'H2 (ml/L.h)
2000
1500
1000
500
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Charge organique (g glucose / L . h)
Intérêt pour les bioréacteurs à haut transfert L/G
 Lit arrosé / trickle-bed
 Vitesse superficielle élevée du liquide et du gaz
33
Discussion générale - perspectives
3. Potentiel élevé de la production d’H2 par dark fermentation
 mieux adapté que les autres bioprocédés pour des
applications industrielles à partir de biomasse et eaux usées
 réduction de pollution + production d’énergie
 300 m³ H2 par tonne de DCO
 12-15 m³ H2 par m3bior. par jour
(digestion anaérobie classique: 0,3 – 6 m³ CH4 / m³.j)
 substrats = résidus liquides ou solides contenant des
carbohydrates (amidon, saccharose, lactose, …)
 poursuivie par une biométhanisation efficace
34
Brewery effluents
10 000 m3/d wastewaters
1400 mg/L DBO5
Residual
organic
matter
Exemple d’installation de ~1,5 MW
230 kW
4200 m3 H2
CO2 + H2
230 kW
530 kW
Biogas
treatment
Fuel cell
3000 m3
1200 kW
Engine or
steam power
Bioreactor
I
Bioreactor
II
+ hot
water
Ultimate
treatment
Steam and
mechanic energy
Natural
environment
35
Discussion générale - perspectives
4. Evaluation des coûts de production
140
Mat. Prem.
Optimisation de la
source d’azote et
protéomique
 C. Hamilton (14 juin 15h)
Produits ch.
100
Coût de production (€/MWh)
Optimisation du bioréacteur
à lit arrosé/trickle bed
J. Masset : supports,
consortia, substrats, …
C. Hamilton & M. Calusinska :
rôle des hydrogénases, …
L. Beckers : quantif.° du
rôle de PH2, catalyseurs, …
R. Puhulwella : support dense,
modélisation, …
120
80
Utilités
60
Coût invest : DA
40
Coût invest : bio-H2
20
Coût invest : Pret
0
2 étages
1 étage
D’après Ljunggren (2010)
36
Discussion générale - perspectives
5. Positionnement technologique de la digestion anaérobie
Matière org.
SUGAR
Process
D’après Sorensen (2011)
Digestion anaérobie (H2 + CH4) : polyvalence, flexibilité,
coût et impact environnemental réduits, …
37
Conclusions
•
souches pures de bactéries anaérobies strictes 
faisabilité de la production de biohydrogène par “dark
fermentation” à partir de mono- et polysaccharides
•
plusieurs paramètres optimisés
 amélioration significative des rendements (x3) et
productivité des bioréacteurs (x8)
 bioréacteurs à haut transfert L/G favorables
•
place centrale et idéale de la digestion anaérobie (H2 +
CH4) dans le panel des technologies exploitant les
biomasses résiduaires ou agricoles pour
produire de l’énergie verte/renouvelable
38
Merci de votre attention
http://cwbi.fsagx.ac.be
www.microh2.ulg.ac.be
39
40
Tab. II.1. Bilan global des besoins en hydrogène de l’industrie mondiale (Source Debiais 2008)
Secteur industriel
Consommation mondiale
(109 Nm³/an)
Production d’ammoniac
Fabrication d’autres produits chimiques
Pétrochimie
212
98
320
Tab. II.2. Principaux procédés chimiques et biologiques de production d’hydrogène
Procédé (nature de l’apport énergétique)
Equation de transformation chimique du procédé complet
Procédés thermochimiques (calories)
Reformage du méthane
Oxydation partielle d’hydrocarbures
Gazéification du charbon
Gazéification de biomasse
CH4 + 2H2O → CO2 + 4H2
C10H14 + 3 H2O + 4 O2 → 9 CO + CO2 + 10H2
3C + 4 H2O + O2 → 3CO2 + 4H2
C6H9O4 + 2 H2O →6 CO + 6,5 H2
Procédé électrochimique (électricité)
Electrolyse de l’eau
2H2O → 2H2 + O2
Procédés biologiques phototrophes (énergie lumineuse)
Biophotolyse directe
Biophotolyse indirecte
2H2O → 2H2 + O2
12H2O + 6CO2 → C6H12O6 + 6O2
C6H12O6 + 12H2O → 6CO2 + 12H2
CH3COOH + 2H2O → 2CO2 + 4H2
Décomposition photosynthétique
Procédés biologiques chimiotrophes (substrat organique)
C6H12O6 + 2H2O → 2CH3COOH + 2CO2 + 4H2
Fermentation acétique
+ 2CO2 + 2H2
CH
CH3CH2+
C6H
butyrique
Fermentation
2COOH
6 → COOH
Acetic acid production
C H O + 2H O
→12O
2CH
2CO
+ 4H
6
Butyric acid production
Acetoclastic methanogenesis :
Hydrogenotrophic methanogenesis :
12
6
2
3
2
C6H12O6 → CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2H2
CH3COOH → CH4 + CO2
4H2 + CO2 → CH4 + 2H2O
2
(1)
(2)
(3)
(4)
41
Tableau … : Propriétés physico-chimiques du dihydrogène
Poids moléculaire
2,016 g/mol
Masse atomique
1,0079 g/mol
Température de solidification
14 °K (-259,2 °C)
Température d’ébullition
20,3 °K (-252,9 °C)
Densité liquide à 20,3 °K
70,79 kg/m³
Densité gazeuse à 20,3 °K
1,34 kg/m³
Densité gazeuse à 273 °K et 1atm
Tableau… : Comparaison des énergies massiques et de volumiques pour divers carburants
Vecteur
énergétique
Forme de stockage
Hydrogène
Gaz (30 MPa)
Liquide (-253°C)
Coefficient de diffusion
0,61 cm²/s
Métal hybride
PCI (Pouvoir Calorifique Inférieur)
120 kJ/kg
Gaz (20 MPa)
142 kJ/kg
Gaz (24,8 MPa)
Température d’auto-inflammation dans l’air
858 °K
Température de flamme dans l’air à 300°K
2318 °K
Energie par unité
de volume
(kWh/l)
Gaz (20 MPa)
Gaz (24,8 MPa)
0,08988 kg/Nm³
PCS (Pouvoir Calorifique Supérieur)
Energie par
unité
de masse
(kWh/kg)
Gaz naturel
Gaz (30 MPa)
0,53
0,64
33,3
0,75
2,36
0,58
3,18
2,58
3,01
13,9
3,38
Liquide (-162°C)
5,8
LPG (Propane)
Liquide
12,9
7,5
Méthanol
Liquide
5,6
4,42
Limites d’inflammabilité dans l’air
4 – 75 (% vol)
Limites de détonabilité dans l’air
13 – 65 (%vol)
Gasoline
Liquide
12,7
8,76
0,020 mJ
Diesel
Liquide
11,6
9,7
Electricité
Batterie au Pb
(chimique)
0,03
0,09
Energie d’inflammation
L’hydrogène s’enflamme dans l’air à pression atmosphérique à des concentrations comprises
entre 4% et 75 % en volume, tandis que, pour comparaison, le méthane a des limites
d’inflammabilités de 5,3% à 15 % et le propane de 2,1% à 9,5 %. Le mélange hydrogène-air est
explosif entre 13 et 65 %, le mélange méthane-air entre 6,3 et 14 %. L’hydrogène est donc un gaz
inflammable et explosif dans des intervalles de concentrations beaucoup plus étendus que les
Sous une pression d’une
atmosphère et à 25°C, sa
solubilité dans l’eau est de 1,57
mg/l  fraction molaire 1,4 E-5
combustibles gazeux usuels, ce qui en fait un gaz réputé dangereux. Associé au fait qu’il est plus
intéressant de le stocker à de hautes pressions, les risques liés à son utilisation sont dès lors bien
réels. Les températures d’auto-inflammation de l’hydrogène, du méthane et du propane dans l’air
Constante de Henry :
1282 L.atm/mol
valent quant à elles respectivement 585°C, 540°C et 487°C. L’hydrogène possède cependant un
coefficient de diffusion de 0,61 cm2/s, environ quatre fois plus important que celui du méthane. En
cas de fuite, il diffuse donc rapidement dans l’air et, vu sa faible densité relative, n’a pas tendance à
stagner. Cela facilite sa dispersion et contribue à le faire sortir rapidement des limites d’explosivité et
d’inflammabilité.
42
0,3 g glucose / L . h  400 mL H2 /g gluc. = 3,2 mol H2 /mol gluc.
3 g glucose / L . h  300 mL H2 /g gluc. = 2,4 mol H2 /mol gluc.
C6H12O6  2,4 H2 + CO2 + 0,9 Acétate + 0,6 Butyrate +
0,1 Lactate + 0,03 Ethanol + 0,6 Biomasse C1HON
Tab. II.3. Temps de latence, potentiel et productivité maximale d’hydrogène à partir de glucose
(concentration initiale dans le milieu de culture variant de 5 à 20 g/L) par différentes souches et
populations de bactéries phototrophes et chimiotrophes (Sources Jeong et al., 2008)
Temps de
latence
(h)
Rhodobacter sphaeroides
présence de lumière
Rhodobacter sphaeroides
absence de lumière
Clostridium Beijenrincki
Bacillus Megaterium
boues de digesteur
Potentiel d’H2
(mmol/mol gluc.)
Moyenne
Ecart-Type
Productivité maximale
(mL H2/L.h)
Moyenne
Ecart-Type
en
40
53,5
21,3
27,5
20,1
40
10
0
10
31,3
122,3
38,8
32,3
8,2
15,3
5,9
26,1
15,9
63,1
29,1
57,3
6,6
16,9
6,6
54,3
en
Absence de substrat carboné azoté  rendements faibles
43
44
Acetic acid production
Butyric acid production
Lactic acid production
Succinic acid production
Formic acid production
Ethanol production
C6H12O6 + 2H2O → 2CH3COOH + 2CO2 + 4H2
C6H12O6 → CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2H2
C6H12O6 → 2CH3CHOHCOOH
C6H12O6 + 2CO2 + H2→ 2(CH2COOH)2 +2H2O
CO2 + H2 → CHOOH
C6H12O6 → 2CH3CH2OH + 2CO2
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
Tab. II.3. Principales réactions du métabolisme des bactéries chimiotrophes menant à la
production d’hydrogène
Glycolyse
Conversion du pyruvate (PFL)
Conversion du pyruvate (PFOR)
Dismutation de l’acide formique (FHL)
Oxydation du NADH (NFOR)
Oxydation de la ferredoxine (Hyd)
glucose + 2 NAD+ + 2 H+ → 2 pyruvate + 2 NADH
2 pyruvate + 2 CoA → 2 acetyl-CoA + 2 formiate
2 pyruvate + 2 CoA + 4 Fd(ox) → 2 acetyl-CoA + 2 CO2 + 4 Fd(rd)
2 formiate + 2 H+ → 2 CO2 + 2 H2
2 NADH + 2 H+ + 2 Fd(ox) → 2 NAD+ + 4 H+ + 2 Fd(rd)
4 Fd(rd) + 4 H+ → 4 Fd(ox) + 2 H2
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
45
46
15th European biosolids and organic resources, Leeds, Nov. 2010 : Two-stage anaerobic digestion S. Hiligsmann
Fig. II.1 : Effet de la pression partielle P H2 sur la production d’hydrogène par les clostridies : (1)
métabolisme du glucose via la glycolyse ou la voie d’Entner-Doudoroff ; (2) décarboxylation oxydative du
pyruvate par la pyruvate ferredoxine oxydoreductase ; (3) formation d’hydrogène par les hydrogenases ;
(4) fermentation butyrique (Angenent et al. 2004).
3 mg H2 / L
Saturation
48
15th European biosolids and organic resources, Leeds, Nov. 2010 : Two-stage anaerobic digestion S. Hiligsmann
Saturation
49
15th European biosolids and organic resources, Leeds, Nov. 2010 : Two-stage anaerobic digestion S. Hiligsmann
50
15th European biosolids and organic resources, Leeds, Nov. 2010 : Two-stage anaerobic digestion S. Hiligsmann
Tab. 1.1 Metabolite analysis during H2 fermentative production form glucose by pure C. Butyricum
CWBI1009 and two sludges from stirred (CSAD) and UASB anaerobic digesters without a pretreatment or
pretreated at 80°C for 10 to 30 min.
C. butyricum CWBI
CSAD
CSAD 10' 80°C
CSAD 30' 80°C
UASB
UASB 10' 80°C
UASB 30' 80°C
Lactate
8.77
16.50
13.57
12.66
19.12
24.97
15.18
Carbon converted from glucose (%)
Formate Acetate
Ethanol Butyrate
CO2
12.07
8.15
0.00
32.05
7.33
10.85
11.33
0.00
36.85
4.08
15.01
8.82
0.00
33.79
6.66
14.09
7.76
0.00
35.34
5.60
13.67
9.97
2.01
24.85
8.89
7.19
1.34
0.00
39.70
10.75
13.36
6.85
0.00
34.61
8.33
Sum
68.38
79.61
77.85
75.44
78.51
83.95
78.32
Tab. 1.2 Metabolite analysis during H2 fermentative production from glucose by different facultative and
strict anaerobic pure strains.
Carbon converted from glucose (%)
Lactate
Formate
Acetate
Ethanol
Butyrate
CO2
Succinate
Sum
C. butyricum 1
18.97
7.21
10.45
1.08
29.15
7.25
0.00
74.12
C. butyricum 2
11.52
9.05
12.73
13.68
33.94
8.48
0.00
89.39
C. butyricum CWBI
12.32
5.72
8.90
13.29
17.81
7.38
0.00
65.41
C. pasteurianum
23.43
2.46
10.09
4.39
22.31
16.89
0.00
79.57
C. saccharolyticum
23.66
6.22
12.78
32.11
7.49
6.50
0.00
88.75
C. acetobutylicum
39.45
0.69
4.96
7.78
13.61
7.09
0.00
73.58
C. aminovalericum
17.71
2.38
8.44
28.79
6.91
5.04
0.00
69.26
C. aurantibutyricum
18.72
0.45
5.96
0.73
11.02
10.01
0.00
68.50
C. puniceum
25.46
4.18
7.70
5.44
20.38
2.22
0.00
69.80
C. thermosaccharolyticum
27.35
1.14
10.43
30.33
9.94
9.37
0.00
88.57
C. thermosulfurigenes
26.12
1.18
9.59
16.11
7.09
7.11
0.00
67.21
Citrobacter freundii
29.20
0.00
24.40
22.40
0.00
2.30
10.50
89.00
Escherichia coli
30.00
0.00
18.50
23.00
0.00
10.00
0.00
81.50
51
Fig. 2.1. Investigation of H2 production by the pure C.
freundii CWBI952 culture growing on glucose at eight
pH values ranging from 3.6 to 8.2 in a 2.3 L batch
bioreactor. (A) Evolution of H2 yield ( ) and biomass (
). (B) Glucose intake rate ( ) and transformation to
formate ( ).
Fig. 2.2. Investigation of H2 production by the pure C.
freundii CWBI952 culture growing on glucose at the
optimum pH (5.9) in a 2.3 L batch bioreactor. (A)
Growth curve ( ) and cumulative hydrogen production (
). (B) Glucose utilization and fermentation profile (
glucose, ethanol, succinate, lactate, formate,
acetate).
52
Tab. 2.1 Metabolite synthesis and performance of H2 production with Citrobacter freundii CWBI952
growing in 100 mL, 2.3 L batch and sequenced-batch cultures.
100 mL serum bottles
2.3 L bioreactor
Nitrogen source and
iron sulfate
concentration in the
medium
Batch
Batch
Sequence 2 Sequence 3
Peptone
without
FeSO4
(NH4)2SO4
without
FeSO4
(NH4)2SO4
with 0.125
g/L FeSO4
Peptone
without
FeSO4
(NH4)2SO4
with 0.125
g/L FeSO4
(NH4)2SO4
with 0.125
a
g/L FeSO4
(NH4)2SO4
with 0.045
a
g/L FeSO4
Mass balance (%)
Ethanol
Lactate
22.4
29.2
14.7
26.1
18.1
23.8
23.7
28.3
18.8
23.5
15.2
29.2
18
26.8
Acetate
Succinate
Formate
24.4
10.5
0
26.4
3.8
11.8
21.22
8.7
0
16.5
9.7
4.9
14.7
9.4
3.9
12.2
8.4
4.5
13.1
9.6
3.4
CO2
2.3
0
3.1
9.6
0
0.2
8.9
Total
88.8
82.9
74.9
92.7
70.3
69.7
79.9
Biomass
(CFU/mL)
Yield
(molH2/molglucose)
Hydrogen production
rate
1.4 10
+09
1.1 10
+09
1.1 10
+09
1.2 10
+09
6.7 10
+08
6.1 10
+08
7.1 10
+08
0.22
0
0.23
0.63
0
0.01
0.58
27.5
0
29
26.4
0
0.54
31.32
(mlH2/L.h)
a. estimated due to removal/addition of culture medium
53
Tab. 2.2. Metabolite synthesis and performance of H 2 production with Citrobacter freundii CWBI 952
growing on (NH4)2SO4 in a 2.3 L semi-continuous culture at different dilution rates.
Dilution rate (h-1)
Mass balance (%)
Ethanol
Lactate
Acetate
Succinate
Formate
CO2
Total
Biomass
(CFU/mL)
Yield
(molH2/molglucose)
Hydrogen production rate
(mlH2/L.h)
a.
Batch
0.009a
0.012
0.018
0.024
0.012
19.3
23.7
14.5
7.9
0
13.5
78.9
21
30.9
14
7.8
0
14.6
88.3
20.3
31.2
13.4
7.1
0
12.8
84.8
19
33.7
13.2
6.4
2.7
11.4
86.4
17.6
35.6
12.1
6.3
0.9
10.6
83.1
19.9
32.6
13.2
7.1
0.8
14.1
87.7
1.2 10
+09
7.8 10
+08
1.4 10
+09
8.2 10
+08
3.4 10
+08
4.5 10
+08
0.88
0.95
0.83
0.74
0.69
0.92
48.2
24.6
33.2
40.2
28.8
25.4
at the end of the first day
54
-1
Fig. 2.3. Effect of various dilution rates (0.009, 0.012, 0.018 and 0.024 h ) on the H2 production activity of
the pure C. freundii CWBI952 growing on glucose in a 2.3 L semi-continuous culture. (A) Hydrogen
production rate (
) monitored during 10 days with GC-TCD and hydrogen yield ( ). (B) Total NH4 ( )
and biomass ( ) contained in the effluents. (C) Glucose utilization and metabolites concentration (
glucose, ethanol, succinate, lactate, formate, acetate).
55
-1 -1
Fig. 3.2. Hydrogen production rate per litre of culture medium (ml H 2 h l ) plotted against time (hours) in
2.3 l batch cultures at different pH levels.
pH 7.3
pH 6.7
pH 6.3
pH 5,85
pH 5,4
pH 5,2
pH 4,85
pH 4,7
56
Fig. 3.3. Metabolite analysis of Clostridium butyricum CWBI1009 glucose fermentation at different pH
-1
levels in a 2.3 l batch bioreactor. Hydrogen production yield (mol H 2 mol glucose), hydrogen production
-1
-1
rate (mmol H2 mol gluc h ) and final VFA concentrations (mM)
Lactate
Formate
Acetate
Ethanol
Butyrate
Hydrogen yield
Hydrogen production rate.
Tab. 3.2. Metabolite analysis of Clostridium butyricum CWBI1009 glucose fermentation at different pH
levels in a 2.3 l batch bioreactor
Carbon converted from glucose (%)
pH
4,7
4,85
5,2
5,4
5,85
6,3
6,7
7,3
Lactate
14,13
13,30
13,53
13,32
11,08
14,35
20,59
13,52
Formiate
4,21
4,2
8,09
6,78
12,07
15,58
17,68
19,10
Acetate
11,03
11,83
11,67
12,06
10,01
11,40
12,25
14,04
Ethanol
0
0
0
2,25
0,72
3,18
2,98
6,83
Butyrate
34,93
40,62
40,34
36,89
32,72
32,42
34,41
28,04
Sum
66,24
69,95
73,63
71,3
66,6
76,93
87,91
81,53
57
Fig. 3.4 Metabolite analysis of Clostridium butyricum CWBI1009 glucose fermentation in a 2.3 l
-1
sequenced-batch bioreactor. Hydrogen production yield (mol H2 mol glucose), hydrogen production rate
-1
-1
(mmol H2 mol gluc h ) and final VFA concentrations (mM)
Lactate
Formate
Acetate
Ethanol
Butyrate
Hydrogen yield
Hydrogen production rate.
Tab. 3.3: Metabolite analysis of Clostridium butyricum CWBI1009 glucose fermentation in a 2.3 l
sequenced-batch bioreactor.
Carbon converted from glucose (%)
Sequence
1
2
3
4
5
6
7
8
Lactate
6.74
0
0
0
1.64
0
0
0
Formiate
7.64
2.62
2.89
0
0
0
0.01
0.06
Acetate
14.03
12.52
14.01
12.25
5.05
15.03
17.12
19.89
Ethanol
5.35
1.47
4.2
3.33
0
3.28
1.62
2.17
Butyrate
37.47
53.3
47.05
58.1
61.6
54.45
50.83
49.6
Sum
71.23
69.91
68.15
73.68
68.29
72.76
69.57
71.72
58
Fig. 3.5: Metabolite analysis of Clostridium butyricum CWBI1009 starch fermentation at different pH levels
-1
in a 2.3 l sequenced-batch bioreactor. Hydrogen yield (mol H2 mol hexose), hydrogen production rate
-1
-1
(mmol H2 mol hexose h ) and final VFA concentrations
Lactate
Formate
Acetate
Ethanol
Butyrate
Hydrogen yield
Hydrogen production rate.
Tab. 3.4: Metabolite analysis of Clostridium butyricum CWBI1009 starch fermentation at different pH levels
in a 2.3 l sequenced-batch bioreactor.
Carbon converted from starch (%)
pH
5.2
5.4
5.6
5.8
Lactate
0
0
2.1
0
Formiate
9.7
7.1
10.2
8.9
Acetate
13.8
14.9
15.7
13.8
Ethanol
6.2
3.4
5.8
5.3
Butyrate
41.6
46.8
44.8
39.2
Sum
71.3
72.2
78.6
67.2
59
35
Lactate
Formate
Acetate
Ethanol
Butyrate
30
20
70
Flocs
60
15
Biogas production (ml)
Metabolites concentrations (mM)
25
10
5
Suspended cells
50
40
30
20
10
0
0
0
batch
1
2
3
4
Sequence number
5
6
7
5
10
Culture duration (hours)
15
Fig. 4.3. Metabolite analysis of Clostridium butyricum CWBI1009 glucose fermentation in a 5 L SBR with
floc retention. Sequences “batch” 1 to 3 were performed without mixing; sequences 4 to 7 were performed
with gentle mixing (60 RPM).
Tab. 4.1. Metabolite analysis of Clostridium butyricum CWBI1009 glucose fermentation in a 5 L SBR with
floc retention. Carbon mass balance for the batch sequence and average balance for the 3 sequences
without mixing and the 4 sequences with gentle mixing (60 RPM).
Lactate
Formate
Acetate
Ethanol
Butyrate
Batch sequence
9
25
9
0
18
Without mixing
12
26
10
2
13
With mixing
4
22
11
3
19
60
20
Tab. 4.2. Successive operating conditions investigated in a 400 mL horizontal fixed-bed reactor inoculated
with the pure strain C. butyricum CWBI1009.
Pseudo hydraulic retention time (h)
60
23
11
8
6
4
1.4
Number of sequences per day
1
7
14
21
28
42
continuous
80
30
30
30
30
30
continuous
Glucose load per hour (g)
0.017
0.04
0.09
0.13
0.18
0.26
0.72
Glucose loading rate (g/l.h)
0.083
0.22
0.44
0.66
0.88
1.31
3.60
Experimental period with the related
mode (days)
1-22
22-34
34-41
41-45
48-50
50-52
52-53
Liquid volume
sequence (ml)
removal/addition
per
61
Cumulative hydrogen production (L)
2,5
2
1,5
1
0,5
0
6
8
10
12
14
16
18
20
22
Fermentation time (d)
Fig. 4.5. Cumulative hydrogen production from glucose in a 400 mL horizontal fixed-bed reactor inoculated
with the pure strain C. butyricum CWBI1009.
Hydrogen production rate
Hydrogen yield
450
400
Hydrogen production rate (mL/L.h)
300
350
250
300
200
250
200
150
150
Hydrogen yield (mL/g glucose)
350
100
100
50
50
0
1
2
3
4
Glucose loading rate (g/L.h)
Fig. 4.6. Evolution of hydrogen production rate per litre of culture medium and yield versus glucose loading
rate in a 400 mL horizontal fixed-bed reactor inoculated with the pure strain C. butyricum CWBI1009.
62
Fig. 4.7. Metabolite analysis in the culture medium at the end of the sequences related to the different GLR
in a 400-mL horizontal fixed-bed reactor inoculated with the pure strain C. butyricum CWBI1009.
Tab. 4.3. Carbon mass balance at the end of the sequences related to the different GLR in a 400 mL
horizontal fixed-bed reactor inoculated with the pure strain C. butyricum CWBI1009. For a GLR of 0.083
g/L.h, two periods were considered : the sequences of days 1 to 10 whereas the pure strain was dominant
and those of days 13 to 21.
GLR (g/L.h)
Lactate
Formate
Acetate
Propionate
Ethanol
Butyrate
0.083 (1-10)
1.8
4.7
0.083 (13-21)
0.1
3.2
15.3
1.2
0.4
51.2
16.7
15.5
4.1
40.6
0.22
2.0
3.2
17.0
20.3
11.4
26.4
0.44
0.66
5.3
2.9
19.8
29.4
3.2
37.3
17.0
0.0
9.1
14.7
7.5
39.8
0.88
1.8
3.8
21.2
20.8
10.1
32.4
1.31
13.0
0.0
16.7
21.8
5.9
26.1
3.6
29.6
0.0
12.8
23.2
1.4
16.3
63
Foamcollecting
vessel
Water bath for
bioreactor
temperature control
Nutrients
feed
Gas-flowmeter
H3PO4 1.5 N
Oxygen
remover
Peristaltic pump
Water
Water
Biogas
sampling
system
C
Bioreactor
Spent
mediumcollecting
vessel
Liquidsampling
tube
PP sieve (section 1 mm²)
Cotton fibers
B
PP support (section 1 cm²)
PP sieve-blade
pHmeter
HRT (h)
10.9
6.6
10.9
6.6
3.9
Volume of liquid phase (ml)
500
500
500
500
300
Liquid volume removal/addition per hour (ml)
46
76
46
76
76
Glucose load per hour (g)
0.21
0.34
0.52
0.86
0.86
Glucose loading rate (g/L h)
0.42
0.68
1.04
1.72
2.87
2
1
1
1
9
Experiment duration with the related HRT (days)
64
Fig. 4.9. Cumulative biogas production and HPR during the pure culture of C. butyricum CWBI1009 in a
2.3 L anaerobic biodisc reactor containing 500 mL of culture medium (First step of the AnBDR operation)
Tab. 4.5. Average carbon mass balance related to different hydraulic retention times in an anaerobic
biodisc reactor with a pure culture of C. butyricum CWBI1009 (the results of days 8 to 11 are related to a
pH at 5.2).
Liquid phase volume (ml)
Duration (d)
Lactate
Formiate
Acetate
Ethanol
Butyrate
500
500
500
500
500
1
2
3
4
5
14
0
0
3
3
4
2
1
0
0
26
30
27
26
28
2
0
0
1
1
38
45
46
38
47
300
300
6
7
5
4
0
0
30
30
0
1
44
43
8
9
10
11
2
2
2
5
1
0
0
0
29
28
29
28
1
1
1
1
39
41
40
41
12
13
14
4
3
4
1
0
0
31
30
34
1
1
1
40
41
47
300
300
300
300
300
300
300
65
Cumulative biogas production
Hydrogen production rate
70
250
210
50
190
170
40
150
30
130
110
20
90
Hydrogen production rate (mL/h)
Cumulative biogas roduction (L)
230
60
10
70
0
50
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
Fermentation time (d)
6,0
7,0
8,0
9,0
Fig. 4.11. Cumulative H2 production and HPR during pure culture of C. butyricum CWBI1009 in an
anaerobic biodisc reactor containing 300 mL of culture medium. (Second step of the AnBDR operation)
66
80
glucose
lactate
formate
acetate
ethanol
butyrate
propionate
2,5
Hydrogen Yield (mol H2 / mol glucose)
70
Metabolites concentration (mM)
50
1,5
40
1,0
30
20
0,5
10
0
0,0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Sequences
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
Fig. 5.1 : Metabolite analysis during different sequences for fermentative hydrogen production in a 2.3l sequenced batch bioreactor : Hydrogen production yield (mol H 2 /
mol glucose), and final metabolites concentrations (mM)
Tab. 5.1 : Metabolites yields expressed as carbon converted (%) from glucose during different sequences for fermentative hydrogen production in a 2.3l sequenced
batch bioreactor.
Sequence number
Lactate
Formate
Acetate
Ethanol
propionate
Butyrate
1
0,0
9,0
7,7
0,8
0,0
50,2
2
0,0
6,2
8,3
0,7
0,0
56,9
3
0,0
3,0
12,2
0,5
0,0
45,1
4
0,0
1,2
13,5
1,3
0,0
51,6
5
0,0
3,8
16,0
0,6
1,3
54,0
6
0,0
4,5
13,6
2,6
0,4
61,8
9
0,0
2,3
9,0
1,6
0,9
52,7
10
0,0
0,7
8,4
1,4
0,2
57,8
11
0,0
3,7
8,7
2,1
0,6
55,6
12
0,0
0,7
2,1
0,2
-0,6
63,7
13
0,0
0,6
-0,2
2,2
0,8
61,8
14
0,0
1,3
5,1
2,1
-0,5
59,5
15
0,0
2,5
6,0
0,9
0,0
53,0
16
0,0
0,9
3,2
0,5
0,0
58,0
Sum
67,7
72,1
60,8
67,6
75,7
82,8
66,5
68,6
70,8
66,1
65,3
67,5
62,3
62,6
Sequence number
Lactate
Formate
Acetate
Ethanol
propionate
Butyrate
Sum
17
0,0
0,2
-1,1
1,2
0,0
56,7
57,0
18
2,1
2,1
-1,2
3,2
0,0
47,1
53,3
19
-1,2
6,7
2,0
1,7
0,0
54,7
64,0
20
0,0
-2,1
7,0
5,8
1,6
52,7
65,2
21
49,4
4,8
12,1
5,1
-0,9
25,1
95,6
22
-8,2
3,1
-6,8
7,7
0,0
70,8
66,6
23
42,8
-3,5
-1,4
-0,7
0,0
32,4
69,5
24
40,5
0,0
0,0
-3,6
0,0
32,8
69,7
25
24,7
0,0
0,0
0,0
0,0
45,4
70,1
26
-5,5
0,0
0,0
0,0
0,0
67,0
61,5
27
-7,5
0,0
0,0
0,0
0,0
70,5
63,0
28
0,9
2,9
0,0
0,0
0,0
49,1
52,9
29
-2,9
0,5
0,0
0,0
0,0
74,2
71,9
30
-0,4
3,0
1,4
2,8
1,4
42,4
50,6
31
0,0
0,2
1,0
-1,6
-0,8
57,4
56,2
32
0,0
0,8
2,1
0,0
0,0
48,2
51,1
33
0,0
-0,4
2,3
0,0
0,0
80,2
82,2
67
34
121,0
-0,5
-2,3
0,0
1,6
-36,4
83,4
Hydrogen yield (mol H2/mol glucose)
2,0
60
50
Cumulative biogas production
3,50
Biogas production rate
45
3,00
2,50
35
30
2,00
25
1,50
20
15
1,00
10
0,50
5
0
Biogas production rate (l/d)
Cumulative biogas production (l)
40
0,00
0
10
20
30
40
Time (d)
50
60
70
80
Fig. 5.2 : Cumulative biogas
300 production (l) and biogas production rate (l/d) in a 20 l anaerobic digester fed
with spent medium from fermentative hydrogen production. The vertical lines indicate the removal-addition
of spent medium (starting a new sequence).
Methane yield (mL CH4/g COD)
250
200
150
100
50
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Sequences
Fig. 5.3 : Methane production yields (ml CH4 / g COD initially loaded in the first stage) for different
sequences in a 20 l anaerobic digester fed with 4 liters of spent medium from fermentative hydrogen
nd
production (2 series of experiments).
68
800
rendement H2 (mL/g hex.)
débit H2 (mL/L.h)
700
600
500
400
300
200
100
0
C. past.; Cit. f.; 250 Cit. f.;
Cit. f.;
250 mL mL non
2,3L
2,3L
non agité agité - pH batch - pH CSTR - pH var.
var.
5,9
pH 5,9
CM
CM
UASB;
UASB;
2,3 L 2,3 L SBR
batch - pH - pH 5,2
5,2
C. but. ;
250 mL
non agité
- pH var.
C. but. ;
5L batch
non agité
- pH var.
C. but. ; C. but. ; C. but. ; C. but. ;
5L SBR 5L SBR
2,3L
2,3L SBR
non agité agité - pH batch - pH - pH 5,2
- pH var.
var.
5,2
C. but. ; C. but. ; C. but. ; C. but. ;
400 mL 500 mL 300 mL 300 mL
HFBR - AnBDR - AnBDR - AnBDR pH 5,9
pH 5,1
pH 5,2
pH 5,6
69
70
71
72
73
74
75