Transcript Enzymologia I Kinetyka - program Gepasi Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii Zakład Regulacji Metabolizmu I zasada + II zasada termodynamiki zmiana entalpii i entropii może zostać wyrażona ilościowo.

Enzymologia I
Kinetyka - program
Gepasi
Uniwersytet Warszawski
Wydział Biologii
Zakład Regulacji
Metabolizmu
I zasada + II zasada termodynamiki
zmiana entalpii i entropii może zostać wyrażona ilościowo jako
zmiana energii Gibbsa G
G jest ilościowym pomiarem netto
"siły napędowej” procesów termodynamicznych
W procesach w których następuje spadek energii Gibbsa (G<0)
zachodzi wzrost netto entropi układu i otoczenia
- proces zachodzi spontanicznie
G = H-TS
zmiana energii Gibbsa  G
-G
A
B
-G
+G
+G
A
B
G = 0
0.001K
0.01K
0.1K
Iloraz masowy
K
10K
[B]/[A]
100K
1000K
Reakcja wzajemnej przemiany A i B w C i D przebiega w układzie zamkniętym:
Stała równowagi reakcji K
aA + bB  cC + dD
Stała równowagi reakcji K
[C ] eq  [ D] eq
K
a
b
[ A] eq  [ B] eq
c
d
gdzie stężenia reagentów przyjmują wartości równowagowe (eq).
Iloraz masowy ( ) w stanie odległym od stanu równowagi
[C] obs  [ D] obs

a
b
[ A] obs  [ B] obs
c
d
gdzie stężenia reagentów odpowiadają wartościom obserwowanym (obs)
G = 2,3 RT log10  /K
Zmianę energii Gibbsa,
kiedy a moli A i b moli B ulega przemianie w c moli C i d moli D,
przy ilorazie masowym  różnym od stałej równowagi reakcji K
gdzie R - stała gazowa a T - temperatura w skali bezwzględnej
Wartość G jest funkcją oddalenia reakcji od stanu równowagi.
W 25oC wartość G dla reakcji oddalonej od stanu równowagi o
jeden rząd wielkości (10 razy) będzie wynosiła zatem 5.7 kJ mol-1.
Gdy iloraz masowy  jest mniejszy niż stała równowagi K to
G<0, a jeśli  >K to G>0.
Gdy obserwowany iloraz masowy ( ) równa się jedności, funkcja G
określana jest jako Go czyli standardowa zmiana energii Gibbsa (wzór *).
Podstawienie tej zależności do ogólnego wzoru na zmianę energii Gibbsa
(G) umożliwia napisanie równania w którym można pominąć wartość
stałej równowagi (wzór **). Jest to najczęściej spotykana postać tego
równania.
* G0 = -2,3 RT log10 K
** G = G0 + 2,3 RT log10 
warunkiem zajścia reakcji jest utrzymanie układu
w stanie oddalonym od stanu równowagi
warunkiem zachodzenia reakcji w komórce
jest utrzymywanie stężeń reagentów
w stanie oddalonym od stanu równowagi
(dSkomórki 0) + (dSotoczenia 0) 0
A. Kinetyka reakcji niekatalizowanej
Reakcje odwracalne i nieodwracalne
Reakcja nieodwracalna
10
8
6
4
2
0
0
1
2
[S]t
time
3
4
[P]t
5
Reakcja odwracalna k1=k2=1
10
8
6
4
2
0
0
1
2
[S]t
time
3
4
[P]t
5
Reakcja odwracalna k1=1 k2=2
10
8
6
4
2
0
0
1
2
[S]t
time
3
4
[P]t
5
Reakcja odwracalna k1=2 k2=1
10
8
6
4
2
0
0
1
2
3
4
time
[S]t
[P]t
5
S + S -> P
10
8
6
4
2
0
0
1
2
3
4
time
[S]t
[P]t
5
0.7
Reakcja niekatalizowana
V reakcji zmienna, można wyznaczyć V 1/2
0.6
0.5
V1
V2
V 1/2
0.4
V3
0.3
0.2
0.0
1.0
2.0
czas [min]
3.0
4.0
B. Model kinetyki reakcji
enzymatycznej wg. Michaelisa-Menten
wg Michaelisa - Menten
10
8
6
4
2
0
0
5
10
15
20
25
time
[E]t
[S]t
[ES]t
[P]t
k1
k2
E S ES E P
k
1
czas [jednostki umowne]
k1
Założenia teorii Michealisa-Menten
Definicja stanu stacjonarnego
k2
E S ES E P
k
1
d [ES]
0
dt
E = const
v

d [S]
 k2 [ES]
dt
V0 - szybkość reakcji wyznaczona w stanie stacjonarnym
ekstrapolowana do czasu t0 i odniesiona do [S]0
k 1
k 2
Założenia teorii Michealisa-Menten
Równanie M-M i stałe kinetyczne
E  S  ES  E  P
k 1
k+1[E][S0]= (k+2 +k-1)[ES]
K  k +k
k
m
-1
+1
+2
Vpoczątkowa reakcji enzymatycznej
0
-0,06
-0,12
-0,18
-0,24
-0,30
0,0
1,0
2,0
Czas [min]
3,0
4,0
Model M-M, różne początkowe stężenia substratu
25
1
0.9
20
0.8
0.7
15
0.6
0.5
10
0.4
0.3
5
0.2
0.1
0
0
0
5
10
15
20
25
time
0
5
10
15
time
[P]t
Krzywe progresji
Zmiana szybkości w czasie
20
25
J(R2)
Odczytywanie wartości S0 i V0 z symulacji w programie Gepasi
Stężenie początkowe
substratu
Odpowiadajaca
szybkość
początkowa
S 5V 5
S 4V 4
0 .0 30
S3V 3
0 .0 20
S 2V 2
S 1V 1
0 .0 10
0 .0 00
0 .0 0
0 .0 2
0 .0 4
S0 [mM]
0 .0 6
0 .0 8
0 .1 0
V0= k+2[ES]
Vmax = k+2 [Ecał]
[E]= [Ecał]-[ES]
V k [E ]
0
2
cal
[S]
[S] + K
0
0
m
V

[S]
V
[S] + K
max
0
0
0
m
Vmax
0 .0 30
0 .0 20
V0  1  Vmax
2
V  V  [S]
[S] + K
max
0
0
0 .0 10
0
m
0 .0 00
0 .0 0
0 .0 2
[S]0 = Km
0 .0 4
0 .0 6
[S]0 [mM]
0 .0 8
0 .1 0
Wykres Lineweavera-Burke'a
E
ES
E+P
tg   K m
V max
-1/Km
1/Vmax
1 
V0
1  Km  1
Vmax Vmax S0
1/[S] pocz. [1/mM]
C. Hamowanie reakcji enzymatycznych
Współzawodnicze
Model hamowania współzawodniczego - inhibitor nieobecny
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
1
1
0.5
0.5
0
0
-0.5
-0.5
-1
-1
10 20 30 40 50 60 70
0 10 20 30 40 50 60 70
time
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
10 20 30 40 50 60 70
time
0 10 20 30 40 50 60 70
time
time
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 10 20 30 40 50 60 70
0 10 20 30 40 50 60 70
time
time
Model hamowania współzawodniczego - inhibitor obecny
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
50
0.8
49.9
0.7
49.8
0.6
49.7
0.5
49.6
0.4
49.5
0.3
49.4
0.2
49.3
0.1
49.2
0
10 20 30 40 50 60 70
time
50
48
46
44
42
40
38
36
34
32
30
0 10 20 30 40 50 60 70
time
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
10 20 30 40 50 60 70
time
0 10 20 30 40 50 60 70
time
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 10 20 30 40 50 60 70
time
0 10 20 30 40 50 60 70
time
Hamowania współzawodnicze - stałe początkowe stężenie substratu i inhibitora
[ES]
[EI]
1
1
0.9
0.8
0.5
0.7
0.6
0.5
0
0.4
0.3
-0.5
0.2
0.1
0
-1
0
10
20
30
40
50
60
70
0
10
20
30
time
40
50
60
70
time
0.4
0.8
0.35
0.7
0.3
0.6
0.25
0.5
0.2
0.4
0.15
0.3
0.1
0.2
0.05
0.1
0
0
0
10
20
30
40
time
50
60
70
0
10
20
30
40
time
50
60
70
Hamowania współzawodnicze - wzrastające początkowe stężenie substratu, stałe stężenie inhibitora
60
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
50
0.8
49.9
0.7
49.8
0.6
49.7
0.5
49.6
0.4
49.5
0.3
49.4
0.2
49.3
0.1
49.2
0
70
0
time
10 20 30 40 50 60 70
0
time
1
0.9
450
0.9
0.8
400
0.8
0.7
350
0.7
300
0.6
250
0.5
200
0.4
150
0.3
100
0.2
0.2
50
0.1
0.1
0
0
0
10 20
30 40 50
time
60 70
40 50 60 70
time
500
0
10 20 30
0.6
0.5
0.4
0.3
0
10 20 30
40 50 60
time
70
0
10 20 30
40 50 60 70
time
50
50
45
45
A
40
B
40
35
35
30
30
25
25
20
20
15
15
10
10
5
5
0
0
0
10
20
30
40
50
60
0
70
10
20
30
40
50
60
70
time
time
50
C
45
40
35
A - bez inhibitora
B- z inhibitorem
30
25
20
C- inhibitor + wzrastające
początkowe stężenie substratu,
15
10
5
0
0
10
20
30
40
time
50
60
70
Hamowania współzawodnicze - wzrastające początkowe stężenie substratu,
stałe stężenie inhibitora
Strzałki wskazują wzrastające stężenie substratu
0.9
0.8
0.8
0.7
0.7
0.6
0.6
0.5
0.5
0.4
0.4
0.3
0.3
0.2
0.2
0.1
0.1
0
0
0
10
20
30
40
time
50
60
70
0
10
20
30
40
time
50
60
70
Hamowania współzawodnicze - wzrastające początkowe stężenie substratu,
stałe stężenie inhibitora
Stała szybkości tworzenia kompleksu EI zwiększona do 50
7
50
49.9
49.8
49.7
49.6
49.5
49.4
49.3
49.2
49.1
49
6
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
time
50
60
70
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
10 20 30 40 50 60 70
time
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
10 20 30 40 50 60 70
time
0
10 20 30 40 50 60 70
time
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0
10 20 30 40 50 60 70
time
0
10 20 30 40 50 60 70
time
Hamowania współzawodnicze - wzrastające początkowe stężenie substratu,
stałe stężenie inhibitora
Stała szybkości tworzenia kompleksu EI zwiększona do 50
wybrane rysunki
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
10
20
30
40
50
60
70
time
0.12
7
0.1
6
5
0.08
4
0.06
3
0.04
2
0.02
1
0
0
0
10
20
30
40
time
50
60
70
0
10
20
30
40
time
50
60
70
EI
E
ES
Inhibicja współzawodnicza
E+P
Kontrola
+ Inhibitor
Ki  EI
E +I
1 
V0
-1/Km*
1  Km  1 [I]0   1
Vmax Vmax 
KI  [S]0
1/Vmax
-1/Km
1/[S] pocz. [1/mM]
C. Hamowanie reakcji enzymatycznych
Niewspółzawodnicze
Hamowania niewspółzawodnicze
50
50
45
45
40
40
35
35
[I] = 0
30
[I] = 50
30
25
25
20
20
15
15
10
10
5
5
0
0
0
10
20
30
40
50
60
70
0
10
20
30
40
50
60
time
time
1.6
1.4
[I] = 50
[S]i od 5 do 500
1.2
1
0.8
0.6
0.4
Wykres w innej skali
niż pozostałe
0.2
0
0
10
20
30
40
time
50
60
70
70
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Hamowania niewspółzawodnicze
[I] = 50
[S]i od 5 do 500
0
10
20
30
40
50
60
70
time
0.02
0.018
0.016
0.014
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
0.002
0
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0
10
20
30
40
time
50
60
70
0
10
20
30
40
time
50
60
70
Inhibicja niewspółzawodnicza
E+P
Kontrola
E
ES
+ Inhibitor
EI
ESI
-1/Vmax*
-1/Km
Ki  EI  EIS
E +I
ES  I
1/Vmax
1 
V0
1  1  [I]0   K m 1
V max 
K I  V max [S]0
1/[S] pocz. [1/mM]
Jednostki aktywności
kcat określa maksymalną aktywność enzymu niezależnie od
jego ilości
Liczba mikromoli substratu przetworzona przez 1 mikromol
enzymu w jednostce czasu w warunkach wysycenia
stężeniem substratu
kcat
Vmax   mol / s   1 





nenzymu   mol   s 
Jednostka standardowa aktywności enzymatycznej
Międzynarodowa jednostka aktywności enzymatycznej
U unit
  mol 
1U 

 min 
Taka ilość enzymu (aktywności enzymatycznej) ,
która katalizuje przemianę 1 mikromola substratu
w ciągu jednej minuty
w warunkach optymalnych i przy pełnym
wysyceniu enzymu stężeniem substratu
Jednostka aktywności enzymatycznej
w układzie SI, katal
 mol 
1kat 

s


6
1kat  6*10 U
Aktywność całkowita preparatu enzymatycznego
=
Aktywność całkowita w określonej objętosci lub ilości preparatu
enzymatycznego
[mole min-1] = U
U
mg
Aktywność właściwa preparatu enzymatycznego
=
Aktywność całkowita/ zawartość białka w preparacie
enzymatycznym
[mole min-1 / mg białka]