Transcript Desafíos en el Laboratorio de Endocrinología
Slide 1
Jornadas de Endocrinología de Zona Norte
Desafíos en el Laboratorio de Endocrinología
Dr. Gustavo Maccallini
21 de Agosto de 2014
Slide 2
Desafíos en el Laboratorio de
Endocrinología
• Evolución de las mediciones hormonales
• Características de los métodos utilizados en
endocrinología
• Interferencias - Limitaciones
• Variabilidad de resultados
Slide 3
Evolución de las Mediciones
Hormonales
• Desarrollo de métodos competitivos
• Desarrollo de métodos no competitivos que utilizan Acs.
Monoclonales. Mejoramiento en especificidad
• Incorporación de señales no radiactivas de alta actividad
específica. Aumento de sensibilidad
• Introducción de sistemas automáticos de procesamiento
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Sistemas de Medición
• Marca Radioactiva:
RIA/IRMA
• Marca Enzimática:
EIA/ELISA
• Marca Fluorescente: FIA/IFMA
• Marca Quimioluminiscente QLIA/ICMA
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Métodos de Medición
Hormonas Proteicas: Métodos no competitivos
Hormonas Esteroideas: Métodos competitivos
Slide 6
Desafíos en el Laboratorio de
Endocrinología
• Evolución de las mediciones hormonales
• Características de los métodos
Sensibilidad
Especificidad
Diferencia entre métodos
• Interferencias - Limitaciones
• Variabilidad de resultados
Slide 7
Métodos de Medición de Hormonas
• Sensibilidad: Mínima concentración medible
• Especificidad: Reconocimiento de la molécula a medir.
Slide 8
Ensayos Inmunométricos Sistemas IMA
Fase
sólida
Ac. Captura
TSH
Ac. Señal
Señal
Slide 9
Métodos de Medición de TSH
• 1º Generación :
1 - 2 uUI/ml.
• 2º Generación : 0.1 - 0.2 uUI/ml.
• 3º Generación:
0.01 - 0.02 uUI/ml.
Slide 10
Relación entre TSH y T4L
TSH
1000
mUI/L
100
10
4
Rango de
Referencia de
TSH
1.0
0.4
0.1
0.01
Indetectable
Hipotiroidismo Rango de Referencia de T4L
Hipertiroidismo
T4L
0.7
1.8 ng/dl
Spencer, JCEM 70: 453, 1990
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Desafíos en el Laboratorio de
Endocrinología
• Evolución de las mediciones hormonales
• Características de los métodos
Sensibilidad
Especificidad
Diferencia entre métodos
• Interferencias - Limitaciones
• Variabilidad de resultados
Slide 12
Reacción Cruzada en la Medición de
17 OH P4
• 17 OH Pregnenolona Sulfato
2.00 %
• 17 OH Pregnenolona
0.79 %
• Progesterona
0.39 %
• 11 Desoxicortisol
0.28 %
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Reacción Cruzada en 17 OH Progesterona en
Recién Nacidos
Extracción con Eter Etílico
17 OH Progesterona 17 OH Progesterona
Suero (ng/ml)
Post Ext (ng/ml)
Mayor de 10
2,6
22
3,1
Mayor de 10
2,2
8,0
3,5
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Reacción Cruzada en la Medición de
Cortisol
•
•
•
•
•
•
•
•
Aldosterona
Cortisona
11Desoxicortisol
21 Desoxicortisona
Dexametasona
Prednisolona
Prednisona
Progesterona
0.01 %
0.6 %
0.25 %
0.04 %
0.53 %
46 %
3.1 %
0.15 %
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Desafíos en el Laboratorio de
Endocrinología
• Evolución de las mediciones hormonales
• Características de los métodos
Sensibilidad
Especificidad
Diferencia entre métodos
• Interferencias - Limitaciones
• Variabilidad de resultados
Slide 16
Desafíos Técnicos en la Medición de Estradiol
Mujeres que reciben terapia
con gonadotrofinas
(Rep. Asist)Mu
0,1
1
10
100
1000
Log de la Concentración de Estradiol
(pg/ml)
Rosner W, JCEM 2013, doi:10.1210, 1-12
Slide 17
Desafíos Técnicos en la Medición de Estradiol
Mujeres que reciben terapia
con gonadotrofinas
(Rep. Asist)Mu
Mujeres PremenopáusicasMu
0,1
1
10
100
1000
Log de la Concentración de Estradiol
(pg/ml)
Rosner W, JCEM 2013, doi:10.1210, 1-12
Slide 18
Desafíos Técnicos en la Medición de Estradiol
Mujeres que reciben terapia
con gonadotrofinas
(Rep. Asist)Mu
Mujeres PremenopáusicasMu
Mujeres Postmenopáusicas/
HombresMu
0,1
1
10
100
1000
Log de la Concentración de Estradiol
Rosner W, JCEM 2013, doi:10.1210, 1-12
(pg/ml)
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Desafíos Técnicos en la Medición de Estradiol
Mujeres que reciben terapia
con gonadotrofinas
(Rep. Asist)Mu
Mujeres PremenopáusicasMu
Mujeres Postmenopáusicas/
HombresMu
Niños Prepuberales/Púberesu
0,1
1
10
100
1000
Log de la Concentración de Estradiol
Rosner W, JCEM 2013, doi:10.1210, 1-12
(pg/ml)
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Desafíos Técnicos en la Medición de Estradiol
Mujeres que reciben terapia
con gonadotrofinas
(Rep. Asist)Mu
Inmunoensayo Directo 1° Gen
LC/MS-MS
Inmun. Directo 2° Gen
MS-MS con
Mayor vol .
Inmun. Indir.
Mujeres PremenopáusicasMu
Mujeres Postmenopáusicas/
HombresMu
Niños Prepuberales/Púberesu
0,1
1
10
100
1000
Log de la Concentración de Estradiol
Rosner W, JCEM 2013, doi:10.1210, 1-12
(pg/ml)
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Desafíos en el Laboratorio de
Endocrinología
• Evolución de las mediciones hormonales
• Características de los métodos
Sensibilidad
Especificidad
Diferencia entre métodos
• Interferencias - Limitaciones
• Variabilidad de resultados
Slide 22
Evaluación de 16 métodos para la
medición de TSH
Thienpont L, Clin Chem 56:6; 902-911, 2010
Slide 23
Medición de TSH en Suero
Fase
sólida
Ac. Captura
TSH
Ac. Señal
Señal
Los fabricantes desarrollan ensayos con diferentes Acs Monoclonales
La especificidad de los mismos determinan qué isoformas son
detectadas en suero
Preparación internacional (IRP 80/558) obtenida de hipófisis humanas
Slide 24
Thi
Slide 25
Thienpont L, Clin Chem 56:6; 902-911, 2010
Slide 26
Thienpont L, Clin Chem 56:6; 902-911, 2010
Slide 27
Thienpont L, Clin Chem 56:6; 902-911, 2010
Slide 28
Thienpont L, Clin Chem 56:6; 902-911, 2010
Slide 29
Programas de Armonización
Armonización
TSH
T4 Libre
T4 Total
PTH
Insulina
LH
Hormona de
Crecimiento
IGF-1
Organización
IFCC
IFCC
IFCC
IFCC
IFCC/ADA
IFCC
IFCC
IFCC
Slide 30
Programas de Estandarización
Estandarización
Organización
Estradiol
Endocrine Society/CDC
Testosterona
Endocrine Society/CDC
Vitamina D
CDC
Hemoglobina
Glicosilada
NGSP/IFCC
Slide 31
Slide 32
Slide 33
Slide 34
Porqué es importante
Estandarizar/Armonizar métodos
• Seguridad del paciente
• Guías Clínicas
• Confianza del paciente
• Registros electrónicos de resultados
Slide 35
Desafíos en el Laboratorio de
Endocrinología
• Evolución de las mediciones hormonales
• Características de los métodos utilizados en
endocrinología
• Interferencias - Limitaciones
• Variabilidad de resultados
Slide 36
Interferencia Analítica (IFCC)
Error sistemático de la medición, causado
por un componente de la muestra, que
por sí mismo no produce una señal en el
sistema de medición
Slide 37
Tipo de
Error
Características
Esporádicos
Endógenos
Dependientes
de muestras de
pacientes
Difíciles de
identificar
Causas Posibles
Formas de Minimizar
la ocurrencia
Componentes normales en
exceso
Procedimientos
estandarizados para
muestras hemolizadas,
lipémicas
Alteraciones en calidad de
proteínas
Sustancias que reaccionan
en forma cruzada
Anticuerpos anti analitos,
anti reactivos, isoformas
atípicas
Efecto de altas
concentraciones
Conocimiento de
características del
ensayo
Protocolos para evaluar
interferencias posibles
Protocolos establecidos
para analitos más
vulnerables
Slide 38
Tipo de
Error
Características
Causas Posibles
Asociados a
cambios en
Sesgo
Incorrecta calibración,
calibración vencida.
Incorrecta reconstitución de
calibradores.
Variación lote a lote de
reactivos
Formas de
Minimizar la
ocurrencia
Procedimientos de
control de calidad
Exógenos
Imprecisión
aumentada
Control de calidad
interno y externo
Pipeteo incorrecto, falla de
detección de burbujas,
lavado inadecuado
Slide 39
Minimizando el riesgo de interferencia
Puntos clave
• Sustancias presentes en muestras de pacientes pueden
interferir en inmunoensayos. Falsos resultados elevados o
disminuidos
• Interferencias endógenas pueden poner en riesgo el cuidado
del paciente, resultados falsos
a) No son detectados en general por procedimientos de control
de calidad del laboratorio
b) Son reproducibles dentro del sistema de análisis
c) Puede dar resultados posibles
d) Son relativamente raros
Slide 40
Minimizando el riesgo de
interferencia Puntos clave
• La industria diagnóstica ha introducido estrategias
robustas para reducir los interferentes
• Los laboratorios deben incluir a la robustez en la
selección de plataformas analíticas
Slide 41
¿Cuándo sospechamos Interferencia ?
• Cuando existe discordancia entre resultados
de Laboratorio
• Cuando existe discordancia entre resultados y
datos clínicos de los pacientes
Slide 42
Interferencias en los Inmunoensayos
• Reacción cruzada
• Autoanticuerpos
• Anticuerpos Heterófilos/HAMA
• Factor Reumatoideo
Slide 43
Interferencias en los Inmunoensayos
• Reacción cruzada
• Autoanticuerpos
• Anticuerpos Heterófilos/HAMA
• Factor Reumatoideo
Slide 44
Interferencias por Auto Anticuerpos
Slide 45
Anticuerpos Anti Hormonas Tiroideas
• La prevalencia en la población general varía en función del
método utilizado para su detección ( Interferencia ~ 2 %)
• Aumenta la prevalencia en enfermedad tiroidea autoinmune
• La frecuencia de detección es mayor para T4 que T3
• La concentración fluctúa en el tiempo
• La interferencia genera resultados falsamente elevados
Després N, Clin Chem 1998; 44: 440-454
Slide 46
Anticuerpos Anti Hormonas Tiroideas
• T4 total : 15,7 ug/dl (5,5-12,5) Quimio DPC
• TSH :
2,47 uUI/ml
• AFM :
1/400
(0,5-5)
“
“
(hasta1/400) Aglutinación
Slide 47
Datos Clínicos
• Mujer. 52 años. Diabética tipo II
• Antecedentes de tratamiento por hipotiroidismo
• Sin tratamiento en los últimos 10 años
• Clínicamente eutiroidea
•
Medicación: metformina
Slide 48
Anticuerpos Anti Hormonas Tiroideas
• T3 : 124 ng/dl
(70-200) Quimio DPC
• T4 total : 14,8 ug/dl
(5,5-12,5) “
• T4 libre : > 6 ng/dl
(0,8-1,9) Análogo 1 paso
• TRH/TSH : 1,9/ 17,2 / 15,2 uUI/ml
“
Slide 49
Anticuerpos Anti Hormonas Tiroideas
• T4 libre (análogo de 1 paso) : > 6 ng/dl (0,8-1,9)
• T4 Libre (eq. de diálisis) : 1,3 ng /dl
(0,8-2,7)
• Inmunoprecipitación con PEG-25% :
(hasta 5%)
45 %
• Diagnóstico: Anticuerpos Anti T4
Slide 50
Anticuerpos Anti Hormonas Tiroideas
• T4 Libre Centaur : Mayor de 12 ng/dl (Un paso)
• TSH
Centaur: 4,52 µUI/ml
• T4 Libre Architect : 1,13 ng/dl
(Dos pasos)
• T4 Libre Centaur – 2º Muestra: 9,0 ng/dl
Slide 51
Slide 52
Principio de Medición de T4 L:
Método Análogo Un Paso
Hormona
Tiroidea
Libre
Separación
y Contéo
+
Proteína Transp.
Análogo
marcado
Anticuerpo
Policlonal unido a
fase sólida
Slide 53
Principio: T4L 2 Pasos
Lavado
1° Paso
2° Paso
Slide 54
Interferencias. Anticuerpos Anti Rhutenio?
Instrum.
TSH
T4 Total
Cortisol
Lab # 1
Cobas
Lab # 2
Cobas
0,56
24,4
30,3
0,48
24,9
T4 L: 1,8
28,2
Lab # 3
Vitros
0,57
10,2
17,2
Slide 55
Interferencias por Auto Anticuerpos
Slide 56
Medición de Tiroglobulina
• La medición de Tg es usada en el seguimiento de
pacientes tratados por Cáncer diferenciado de tiroides
• La presencia de Anticuerpos Anti Tg (~ 25 %)
interfiere en la medición de Tg, limitando su utilidad en
la evaluación de recurrencia
• Resultados falsamente disminuidos en
inmunométricos)
Pacini F, Eur J Nucl Med Mol Imaging 2002; 29: S492-6
Spencer C, JCEM 2004; 3702-4
Slide 57
TgAb Effects on Serum Tg Measurement
H u m an
T g Ab
Tg
B ound Tg
Tg
Free Tg
IM A
M E TH OD S
RIA
M E TH O D S
Slide 58
S e r u m T g C o r r e la tio n s b y R IA v s IM A M e th o d s
T g A b N e g a tiv e S e ra (n = 2 1 1 )
T g A b P o sitiv e S e ra (n = 22 2 )
1 ,0 0 0
1 ,0 0 0
25%
46%
100
100
10
10
Tg
IM A 2
n g /m l 1
73%
48%
0 .5
U n d e te c ta b le
1 2
10
10 0
T g R IA (n g /m l)
1 ,0 0 0
Tg
2 IM A
n g /m l
1
0 .5
U n d e te c ta b le
0 .5 1 2
10
1 00
T g R IA (n g /m l)
Spencer et al. Thyroid 9: 435, 1999
1,00 0
Slide 59
Anticuerpos Anti Tiroglobulina en CDT
Spencer C, JCEM 96:3615-27, 2011
Slide 60
Medición de Anticuerpos Anti
Tiroglobulina
Instrumento
Sensib.
Valor de
Ref.
Architect
0,3
Hasta 4,1
Cobas
10,0
Hasta 115
Immulite
10,0
Hasta 40
Slide 61
Medición de Tiroglobulina por LC-MS/MS
Slide 62
Kushnir M, Clin Chem 2013; 59:6, 1-9
Slide 63
Kushnir M, Clin Chem 2013; 59:6, 1-9
Slide 64
Interferencias Isoformas Atípicas
Hormonas Proteicas-Ig G
Prolactina - - - - PEG
TSH
PTH
Slide 65
Métodos Utilizados para Prolactina
Reconocimiento de Macroprolactina
• Baja Reactividad
• Mediana Reactividad
• Alta Reactividad
Slide 66
Interferencias en los Inmunoensayos
• Reacción cruzada
• Autoanticuerpos
• Anticuerpos Heterófilos/HAMA
• Factor Reumatoideo
Slide 67
Anticuerpos Heterófilos/HAMA
• Son Anticuerpos del isotipo Ig G humanos que
reaccionan contra las Inmunoglobulinas de animal
presentes en los reactivos
• Interfieren en ensayos inmunométricos de diferentes
analitos
• Frecuencia variable : 0.2 - 1.5 %
Slide 68
Anticuerpos Heterófilos
¿Cómo se originan?
• Son anticuerpos humanos de baja afinidad,
producidos previo a la exposición antigénica
• Reaccionan con los reactivos de los ensayos
• Ocasionan resultados generalmente elevados en
ensayos inmunométricos
Slide 69
Anticuerpos Heterófilos - HAMA
¿Cómo se originan?
• Anticuerpos humanos anti ratón
• A través de inmunización por exposición con animales
• En pacientes que reciben infusión de Anticuerpos
monoclonales con fines diagnósticos o terapéuticos
Slide 70
Ensayos Inmunométricos Sistemas IMA
Fase
sólida
Ac. Captura
TSH
Ac. Señal
Señal
Slide 71
Ac. Heterófilo
Fase
sólida
Ac. Captura
Ac. Señal
Señal
Slide 72
Interferencia por Anticuerpos Heterófilos
Estrategias para eliminar la interferencia
Fabricantes :
• Agregado de suero no inmune de origen animal en el
reactivo
• Preparación de Anticuerpos quiméricos humano/animal
En el Laboratorio:
• Preincubación del suero con suero no inmune animal
• Re análisis cambiando marca de reactivo
Slide 73
Interferencia por Anticuerpos
Heterófilos en la medición de TSH
Método 1
Método 2
Método 3
0.81 (<0.1)
<0.1
0.08
1.2 (< 0.1)
<0.1
0.04
1.8 (0.63)
0.78
0.64
2.4 (< 0.1)
< 0.1
0.1
9.2 (1.1)
0.98
2.07(0.63)
Nisbet JA, Clin Chem 1986; 32: 201-2
Slide 74
Interferencia por Anticuerpos Heterófilos en
la medición de TSH Acción de Ig G ratón
Ig G agregada
(ug/l)
0
0.61
1.25
2.50
5.0
20.0
TSH
(mUI/L)
8.7
2.7
1.6
0.9
0.4
< 0.05
Nisbet JA, Clin Chem 1986; 32: 201-2
Slide 75
Interferencias en los Inmunoensayos
• Reacción cruzada
• Autoanticuerpos
• Anticuerpos Heterófilos/HAMA
• Factor Reumatoideo
Slide 76
Factor Reumatoideo
• Son Anticuerpos del isotipo Ig M, con especificidad al
fragmento Fc de Ig G humana
• Exhibe unión no específica a los Acs de los reactivos,
actuando sobre Fc de los mismos
• Alta prevalencia en Artritis Reumatoidea (70 %), y en
otras enfs. Autoinmunes
• La interferencia genera usualmente resultados
falsamente elevados
Slide 77
Métodos para evaluar Interferencias
en el Laboratorio
• Repetir el análisis con un inmunoensayo
alternativo que utilice anticuerpos de diferente
especies
• Realizar la medición antes y después del
agregado de reactivo bloqueante
• Isoformas atípicas (Prolactina), uso de PEG
• Realizar diluciones de la muestra y evaluar
linealidad
Slide 78
Desafíos en el Laboratorio de
Endocrinología
• Evolución de las mediciones hormonales
• Características de los métodos utilizados en
endocrinología
• Interferencias – Limitaciones
Efecto Hook
Situaciones clínicas poco frecuentes
• Variabilidad de resultados
Slide 79
Efecto Hook – Altas
concentraciones
Muy altas concentraciones pueden saturar los reactivos
empleados y arrojar resultados Falsamente disminuidos
en métodos inmunométricos
Estrategias metodológicas de dos pasos pueden reducir
la ocurrencia
Reconocer esta posibilidad, es necesario para poder
realizar diluciones seriadas ante resultados falsamente
bajos
Slide 80
Efecto Hook – Altas concentraciones
Resultados
Falsamente
disminuidos
Slide 81
Condiciones Clínicas Poco Frecuentes
• Alteración en el transporte de Hormonas tiroideas:
Alteraciones Congénitas de TBG
Alteraciones adquiridas de TBG
Hipertiroxinemia Disalbuminémica Familiar
Aumento de Afinidad de Transtiretina
• Cambios en la actividad biológica de TSH
Hipotiroidismo central – Actividad biológica
reducida
Slide 82
TBG Elevada
Esteroides
Sexuales
TBG Disminuida
Estrógenos
Andrógenos
• Embarazo
Esteroides anabólicos
Albúmina/TTR
Embarazo
• Anticonceptivos orales
Drogas
5 Fluorouracilo
Glucocorticoides
Heroína/Metadona
L- Asparaginasa
Clofibrate
Acido Nicotínico
Perfenacina
Enfermedad
Hepatitis aguda/crónica
Enfermedad grave - NTI
Insuficiencia suprarrenal
Síndrome Nefrótico
SIDA
Desnutrición
Porfiria intermitente aguda
Acromegalia
Hipotiroidismo
Síndrome de Cushing
Hipertirodismo
Congénito
Exceso
Deficiencia
NTI
Desnutr.
Afinidad:
Albúmina -FDH
TTR
Bartelena, Horm Res 45: 142 -7, 1996
Slide 83
Déficit completo
Paciente T3 Total T4 Total
ng/dl
ug/dl
T4 L
ng/dl
TSH
UI/ml
TBG
mg/l
1
62
2.2
1.2
0.7
1.0
2
50
2.1
1.5
1.7
1.0
3
35
1.1
1.0
1.1
1.0
2.5
0.95
1.54
< 1.0
4
Slide 84
Deficiencia Parcial
Paciente T3 Total T4 Total T4 Libre
ng/dl
ug/dl
ng/dl
TSH
UI/ml
TBG
mg/l
1
66
4.0
1.3
0.87
4.7
2
44
3.4
1.2
4.0
2.6
3
94
3.7
1.0
0.51
3.3
4
39
3.6
0.90
0.80
12.0
5
74
2.6
0.96
2.69
3.6
6
83
3.7
1.20
3.11
3.0
4.0
0.85
0.51
7.6
7
8
89
4.7
0.75
3.72
11.4
9
86
4.4
0.95
1.58
9.7
10
67
4.6
1.2
1.2
6.6
Slide 85
Exceso Congénito
P acien te
T 3 T o tal
n g /d l
1
T 4 T o tal
u g /d l
T4L
n g /d l
TSH
U I/m l
TBG
m g /l
1 4 .0
1 .1
3 .0
76
2
238
1 3 .6
1 .0
1 1 .6
68
3
310
1 9 .5
1 .2
3 .6 6
89
4
289
1 3 .6
1 .3
4 .3
68
Slide 86
Complete Thyroxine-Binding Globulin
deficiency, due to a novel p.A64D mutation,
associated with increased affinity in
Transthyretin (p.A109T mutation) in an
hypothyroid patient
( ITC2010-1135)
Sklate R, Maccallini G, Olcese M, Agüero M,
Sánchez M, González Sarmiento R, Targovnik H,
Niepomniszcze H, Rivolta C
Slide 87
• A 52-year-old man was referred to us for the
management of his hypothyroidism post
thyroidectomy, 30 years earlier.
•
He had a sister and nieces who were hypothyroid.
• He was treated with 150 μg/day of L-T4 and was
asymptomatic.
Slide 88
Results with Elecsys and Clinical status
L-T4
Doses
150 μg/d
Clinical
status
Euthyroid
TSH (μIU/ml) 0.32
FT4 (ng/dl)
(nr: 0.8-1.7)
3.21
T3 (ng/dl)
(nr: 80-200)
66
Slide 89
Results with Elecsys and Clinical status
L-T4
Doses
150 μg/d
Clinical
status
Euthyroid
Hypothyroid
TSH (μIU/ml)
0.32
>100
FT4 (ng/dl)
(nr: 0.8-1.7)
3.21
<0.1
T3 (ng/dl)
(nr: 80-200)
66
<20
Stopped
Slide 90
Results with Elecsys and Clinical status
L-T4
Doses
150 μg/d
Clinical
status
Euthyroid
Hypothyroid
Euthyroid
TSH (μIU/ml)
0.32
>100
3.37
FT4 (ng/dl)
(nr: 0.8-1.7)
3.21
<0.1
3.05
T3 (ng/dl)
(nr: 80-200)
66
<20
Stopped
125 μg/d
Slide 91
Results with Elecsys and Clinical status
L-T4
Doses
150 μg/d
Clinical
status
Euthyroid
Hypothyroid
Euthyroid
Hypothyroid
TSH (μIU/ml)
0.32
>100
3.37
43
FT4 (ng/dl)
(nr: 0.8-1.7)
3.21
<0.1
3.05
1.55
T3 (ng/dl)
(nr: 80-200)
66
<20
Stopped
125 μg/d 88 μg/d
Slide 92
Results with Elecsys and Clinical status
L-T4
Doses
150 μg/d
Stopped
125 μg/d 88 μg/d
Euthyroid
Hypothyroid Euthyroid Hypothyroid
Clinical
Inappropriate TSH secretion:
status
TSH (μIU/ml) 0.32
>100
Resistance to Thyroid Hormone
or
FT4
<0.1
TSH(ng/dl)
Secreting 3.21
Pituitary Adenoma
(nr: 0.8-1.7)
(Normal Pituitary MRI)
T3 (ng/dl)
66
<20
(nr: 80-200)
3.37
43
3.05
1.55
TBG was < 3 mg/l
(17-27 mg/l)
Anti T4Antibodies
Slide 93
Patient euthyroid under L-T4 125 μg/d
Discordance between TSH and FT4
One step
Elecsys
Immulite
TSH
(μIU/ml)
FT4
(ng/dl)
FT3
(pg/dl)
Total T4
(μg/dl)
Total T3
(ng/dl)
3.37
FT4
(ng/dl)3.05
(0.8-1.7)
Two step
Architect
3.19
4.36
(0.8-1.9)
0.8
(0.7-1.48)
1.42
(1.5-4.1)
4.51
(4.9-11.7)
61
Slide 94
T4-binding protein
radioelectrophoresis
TTR-bound T4 was
significantly increased: 92.6
μg/dl
(nr:48.8–70.4)
TBG-bound T4 was absent
Two abnormalities in binding proteins with
opposite effects
Slide 95
TBG gene
Novel mutation c.251C>A (p.A64D)
Hemizygous
Wild-type allele
GCC
Ala (64)
Mutant allele
GAC
Asp (64)
Slide 96
TTR gene
c.385G>A (p.A109T)
Heterozygous
Wild-type allele
GCC
Ala (109)
Mutant allele
ACC
Thr (109)
Slide 97
Conclusions
The combination of two different alterations in binding
proteins, with opposite effects, was the cause of the
discordance between thyroid function test results and clinical
outcome in a male patient without thyroid gland and a
previous history of hyperthyroidism.
Taking into account that a brother had also no detectable TBG
and a sister had low TBG level, these familiar findings lead us to
diagnose an inherited complete TBG deficiency.
This is the first time that simultaneous mutations in these T4binding proteins are reported in the literature. Moreover, one
of them is a novel mutation in the TBG gene producing a lack
of this protein.
Slide 98
Principio de Medición de T4 L:
Método Análogo Un Paso
Hormona
Tiroidea
Libre
Separación
y Contéo
+
Proteína Transp.
Análogo
marcado
Anticuerpo
Policlonal unido a
fase sólida
Slide 99
Principio de Medición de T4 L:
Método Análogo Un Paso
Hormona
Tiroidea
Libre
Separación
y Contéo
+
Proteína Transp.
Análogo
marcado
Anticuerpo
Policlonal unido a
fase sólida
Slide 100
Principio de Medición de T4L por
Método de 2 Pasos
Lavado
1° Paso
2° Paso
Slide 101
Principio de Medición de T4L por
Método de 2 Pasos
Lavado
1° Paso
2° Paso
Slide 102
Condiciones Clínicas Poco Frecuentes
• Alteración en el transporte de Hormonas tiroideas:
Alteraciones Congénitas de TBG
Alteraciones adquiridas de TBG
Hipertiroxinemia Disalbuminémica Familiar
Aumento de Afinidad de Transtiretina
• Cambios en la actividad biológica de TSH
Hipotiroidismo central – Actividad biológica
reducida
Slide 103
Slide 104
Desafíos en el Laboratorio de
Endocrinología
• Evolución de las mediciones hormonales
• Características de los métodos utilizados en
endocrinología
• Interferencias – Limitaciones
• Variabilidad de resultados
Slide 105
Composición de un resultado de
laboratorio
Valor
verdadero
Resultado de la muestra
Variabilidad Pre-analítica
(estimada como irrelevante)
Variabilidad analítica
(imprecisión analítica total)
Bias Analítico
Variabilidad Biológica Intrínseca
(una constante)
VARIABILIDAD TOTAL
Variabilidad Analítica
(imprecisión analítica total)
+ Bias Analítico
= ERROR TOTAL
Slide 106
Tipos de Errores en la Medición
Valor
Verdadero
Incremento en
error aleatorio
Desvío sistemático
Desempeño
analítico estable
Tamaño del error
0
Tamaño del error
Slide 107
05
Ab
r-0
6
Ag
o06
Di
c0
Ab 6
r-0
7
Ag
o07
Di
c0
Ab 7
r-0
8
Ag
o08
Di
c0
Ab 8
r-0
9
Ag
o09
Di
c0
Ab 9
r-1
0
Ag
o10
Di
c10
Ab
r-1
1
Ag
o11
Di
c11
Ab
r-1
2
Di
c-
CV % Mensual
Control de Calidad Interno para TSH-Imprecisión.
14
12
10
Req. V.B. Deseable
8
6
4
Nivel 1
2
0
Nivel 2
Nivel 3
Slide 108
Variabilidad Biológica
Slide 109
Las determinaciones tiroideas tienen estrecha variabilidad
intra-individual con respecto a valores de referencia
TSH
Sujetos individuales
Tiroglobulina
T4 Libre
Sujetos individuales
Sujetos individuales
Variabilidad individual (un año)
Jensen CCLM 45:1058, 2007
Andersen JCEM 87:1068, 2002
Valores de Referencia poblacionales
Slide 110
Variabilidad Biológica y Valores de
Referencia
Las determinaciones de la función tiroidea tienen una
Variabilidad intra-individual baja en relación a la
Variabilidad inter-individual
Indice de Individualidad Bajo
Valores de Referencia específicos por paciente
Slide 111
Slide 112
• Reporte de Resultados – Intervalos de Referencia adecuados –
Evaluación inicial
• Para monitoreo de resultados. Cambios y Respuesta a
tratamientos – (Indices de Individualidad bajos)
Mínimo cambio significativo
VRC = 1.96 . √2 . √(CVI 2 + CVA 2)
CvI = Variabilidad biológica Intraindividual
CVA = Variabilidad Analítica
Mínima diferencia entre dos resultados sucesivos en un
individuo que puede ser considerado para reflejar un cambio
real
Slide 113
Informe de Laboratorio - Resultados
Valor de Referencia para el Cambio/ Delta Check
Significancia clínica de cambio en 2 resultados
consecutivos de un individuo, implica tomar
consideraciones tanto de variación fisiológica como
analíticas
• CVI:
• CVA:
Coeficiente de variación intra- individual
Coeficiente de variación analítico
Slide 114
Informe de Laboratorio - Resultados
Valor de Referencia para el Cambio/ Delta Check
Diferencia entre un resultado de laboratorio actual de
un paciente y el resultado previo que excede un límite
predefinido
• Cambio Significativo *
* Cambio si > VRC = 1.96 . √2 . √(CVI 2 + CVA 2)
*Este resultado difiere significativamente del valor previo
Fraser CG, Crit Rev Clin Lab Sci 1989; 27: 409-37
Slide 115
Slide 116
Slide 117
Slide 118
Slide 119
Desafíos en el Laboratorio Endocrinológico
Tratamiento
Inapropiado
Resultado
Incorrecto
Paciente - Médico
Laboratorio
Condiciones Clínicas
Poco Frecuentes
• Cambios en el
transporte de HT.
• Hipot. Central
• Resistencia a HT
•
•
•
•
Tratamiento
Apropiado
Resultado
Correcto
Interferencias
Autoanticuerpos
Alteración Proteínas
Anticuerpos
Heterófilos/HAMA/FR
Reacción cruzada
Limitaciones
Efecto Hook
Control a Cargo del Lab
Control Preánalìtico,
Analìtico y Post Analìtico
Slide 120
Muchas gracias
por su atención.
Jornadas de Endocrinología de Zona Norte
Desafíos en el Laboratorio de Endocrinología
Dr. Gustavo Maccallini
21 de Agosto de 2014
Slide 2
Desafíos en el Laboratorio de
Endocrinología
• Evolución de las mediciones hormonales
• Características de los métodos utilizados en
endocrinología
• Interferencias - Limitaciones
• Variabilidad de resultados
Slide 3
Evolución de las Mediciones
Hormonales
• Desarrollo de métodos competitivos
• Desarrollo de métodos no competitivos que utilizan Acs.
Monoclonales. Mejoramiento en especificidad
• Incorporación de señales no radiactivas de alta actividad
específica. Aumento de sensibilidad
• Introducción de sistemas automáticos de procesamiento
Slide 4
Sistemas de Medición
• Marca Radioactiva:
RIA/IRMA
• Marca Enzimática:
EIA/ELISA
• Marca Fluorescente: FIA/IFMA
• Marca Quimioluminiscente QLIA/ICMA
Slide 5
Métodos de Medición
Hormonas Proteicas: Métodos no competitivos
Hormonas Esteroideas: Métodos competitivos
Slide 6
Desafíos en el Laboratorio de
Endocrinología
• Evolución de las mediciones hormonales
• Características de los métodos
Sensibilidad
Especificidad
Diferencia entre métodos
• Interferencias - Limitaciones
• Variabilidad de resultados
Slide 7
Métodos de Medición de Hormonas
• Sensibilidad: Mínima concentración medible
• Especificidad: Reconocimiento de la molécula a medir.
Slide 8
Ensayos Inmunométricos Sistemas IMA
Fase
sólida
Ac. Captura
TSH
Ac. Señal
Señal
Slide 9
Métodos de Medición de TSH
• 1º Generación :
1 - 2 uUI/ml.
• 2º Generación : 0.1 - 0.2 uUI/ml.
• 3º Generación:
0.01 - 0.02 uUI/ml.
Slide 10
Relación entre TSH y T4L
TSH
1000
mUI/L
100
10
4
Rango de
Referencia de
TSH
1.0
0.4
0.1
0.01
Indetectable
Hipotiroidismo Rango de Referencia de T4L
Hipertiroidismo
T4L
0.7
1.8 ng/dl
Spencer, JCEM 70: 453, 1990
Slide 11
Desafíos en el Laboratorio de
Endocrinología
• Evolución de las mediciones hormonales
• Características de los métodos
Sensibilidad
Especificidad
Diferencia entre métodos
• Interferencias - Limitaciones
• Variabilidad de resultados
Slide 12
Reacción Cruzada en la Medición de
17 OH P4
• 17 OH Pregnenolona Sulfato
2.00 %
• 17 OH Pregnenolona
0.79 %
• Progesterona
0.39 %
• 11 Desoxicortisol
0.28 %
Slide 13
Reacción Cruzada en 17 OH Progesterona en
Recién Nacidos
Extracción con Eter Etílico
17 OH Progesterona 17 OH Progesterona
Suero (ng/ml)
Post Ext (ng/ml)
Mayor de 10
2,6
22
3,1
Mayor de 10
2,2
8,0
3,5
Slide 14
Reacción Cruzada en la Medición de
Cortisol
•
•
•
•
•
•
•
•
Aldosterona
Cortisona
11Desoxicortisol
21 Desoxicortisona
Dexametasona
Prednisolona
Prednisona
Progesterona
0.01 %
0.6 %
0.25 %
0.04 %
0.53 %
46 %
3.1 %
0.15 %
Slide 15
Desafíos en el Laboratorio de
Endocrinología
• Evolución de las mediciones hormonales
• Características de los métodos
Sensibilidad
Especificidad
Diferencia entre métodos
• Interferencias - Limitaciones
• Variabilidad de resultados
Slide 16
Desafíos Técnicos en la Medición de Estradiol
Mujeres que reciben terapia
con gonadotrofinas
(Rep. Asist)Mu
0,1
1
10
100
1000
Log de la Concentración de Estradiol
(pg/ml)
Rosner W, JCEM 2013, doi:10.1210, 1-12
Slide 17
Desafíos Técnicos en la Medición de Estradiol
Mujeres que reciben terapia
con gonadotrofinas
(Rep. Asist)Mu
Mujeres PremenopáusicasMu
0,1
1
10
100
1000
Log de la Concentración de Estradiol
(pg/ml)
Rosner W, JCEM 2013, doi:10.1210, 1-12
Slide 18
Desafíos Técnicos en la Medición de Estradiol
Mujeres que reciben terapia
con gonadotrofinas
(Rep. Asist)Mu
Mujeres PremenopáusicasMu
Mujeres Postmenopáusicas/
HombresMu
0,1
1
10
100
1000
Log de la Concentración de Estradiol
Rosner W, JCEM 2013, doi:10.1210, 1-12
(pg/ml)
Slide 19
Desafíos Técnicos en la Medición de Estradiol
Mujeres que reciben terapia
con gonadotrofinas
(Rep. Asist)Mu
Mujeres PremenopáusicasMu
Mujeres Postmenopáusicas/
HombresMu
Niños Prepuberales/Púberesu
0,1
1
10
100
1000
Log de la Concentración de Estradiol
Rosner W, JCEM 2013, doi:10.1210, 1-12
(pg/ml)
Slide 20
Desafíos Técnicos en la Medición de Estradiol
Mujeres que reciben terapia
con gonadotrofinas
(Rep. Asist)Mu
Inmunoensayo Directo 1° Gen
LC/MS-MS
Inmun. Directo 2° Gen
MS-MS con
Mayor vol .
Inmun. Indir.
Mujeres PremenopáusicasMu
Mujeres Postmenopáusicas/
HombresMu
Niños Prepuberales/Púberesu
0,1
1
10
100
1000
Log de la Concentración de Estradiol
Rosner W, JCEM 2013, doi:10.1210, 1-12
(pg/ml)
Slide 21
Desafíos en el Laboratorio de
Endocrinología
• Evolución de las mediciones hormonales
• Características de los métodos
Sensibilidad
Especificidad
Diferencia entre métodos
• Interferencias - Limitaciones
• Variabilidad de resultados
Slide 22
Evaluación de 16 métodos para la
medición de TSH
Thienpont L, Clin Chem 56:6; 902-911, 2010
Slide 23
Medición de TSH en Suero
Fase
sólida
Ac. Captura
TSH
Ac. Señal
Señal
Los fabricantes desarrollan ensayos con diferentes Acs Monoclonales
La especificidad de los mismos determinan qué isoformas son
detectadas en suero
Preparación internacional (IRP 80/558) obtenida de hipófisis humanas
Slide 24
Thi
Slide 25
Thienpont L, Clin Chem 56:6; 902-911, 2010
Slide 26
Thienpont L, Clin Chem 56:6; 902-911, 2010
Slide 27
Thienpont L, Clin Chem 56:6; 902-911, 2010
Slide 28
Thienpont L, Clin Chem 56:6; 902-911, 2010
Slide 29
Programas de Armonización
Armonización
TSH
T4 Libre
T4 Total
PTH
Insulina
LH
Hormona de
Crecimiento
IGF-1
Organización
IFCC
IFCC
IFCC
IFCC
IFCC/ADA
IFCC
IFCC
IFCC
Slide 30
Programas de Estandarización
Estandarización
Organización
Estradiol
Endocrine Society/CDC
Testosterona
Endocrine Society/CDC
Vitamina D
CDC
Hemoglobina
Glicosilada
NGSP/IFCC
Slide 31
Slide 32
Slide 33
Slide 34
Porqué es importante
Estandarizar/Armonizar métodos
• Seguridad del paciente
• Guías Clínicas
• Confianza del paciente
• Registros electrónicos de resultados
Slide 35
Desafíos en el Laboratorio de
Endocrinología
• Evolución de las mediciones hormonales
• Características de los métodos utilizados en
endocrinología
• Interferencias - Limitaciones
• Variabilidad de resultados
Slide 36
Interferencia Analítica (IFCC)
Error sistemático de la medición, causado
por un componente de la muestra, que
por sí mismo no produce una señal en el
sistema de medición
Slide 37
Tipo de
Error
Características
Esporádicos
Endógenos
Dependientes
de muestras de
pacientes
Difíciles de
identificar
Causas Posibles
Formas de Minimizar
la ocurrencia
Componentes normales en
exceso
Procedimientos
estandarizados para
muestras hemolizadas,
lipémicas
Alteraciones en calidad de
proteínas
Sustancias que reaccionan
en forma cruzada
Anticuerpos anti analitos,
anti reactivos, isoformas
atípicas
Efecto de altas
concentraciones
Conocimiento de
características del
ensayo
Protocolos para evaluar
interferencias posibles
Protocolos establecidos
para analitos más
vulnerables
Slide 38
Tipo de
Error
Características
Causas Posibles
Asociados a
cambios en
Sesgo
Incorrecta calibración,
calibración vencida.
Incorrecta reconstitución de
calibradores.
Variación lote a lote de
reactivos
Formas de
Minimizar la
ocurrencia
Procedimientos de
control de calidad
Exógenos
Imprecisión
aumentada
Control de calidad
interno y externo
Pipeteo incorrecto, falla de
detección de burbujas,
lavado inadecuado
Slide 39
Minimizando el riesgo de interferencia
Puntos clave
• Sustancias presentes en muestras de pacientes pueden
interferir en inmunoensayos. Falsos resultados elevados o
disminuidos
• Interferencias endógenas pueden poner en riesgo el cuidado
del paciente, resultados falsos
a) No son detectados en general por procedimientos de control
de calidad del laboratorio
b) Son reproducibles dentro del sistema de análisis
c) Puede dar resultados posibles
d) Son relativamente raros
Slide 40
Minimizando el riesgo de
interferencia Puntos clave
• La industria diagnóstica ha introducido estrategias
robustas para reducir los interferentes
• Los laboratorios deben incluir a la robustez en la
selección de plataformas analíticas
Slide 41
¿Cuándo sospechamos Interferencia ?
• Cuando existe discordancia entre resultados
de Laboratorio
• Cuando existe discordancia entre resultados y
datos clínicos de los pacientes
Slide 42
Interferencias en los Inmunoensayos
• Reacción cruzada
• Autoanticuerpos
• Anticuerpos Heterófilos/HAMA
• Factor Reumatoideo
Slide 43
Interferencias en los Inmunoensayos
• Reacción cruzada
• Autoanticuerpos
• Anticuerpos Heterófilos/HAMA
• Factor Reumatoideo
Slide 44
Interferencias por Auto Anticuerpos
Slide 45
Anticuerpos Anti Hormonas Tiroideas
• La prevalencia en la población general varía en función del
método utilizado para su detección ( Interferencia ~ 2 %)
• Aumenta la prevalencia en enfermedad tiroidea autoinmune
• La frecuencia de detección es mayor para T4 que T3
• La concentración fluctúa en el tiempo
• La interferencia genera resultados falsamente elevados
Després N, Clin Chem 1998; 44: 440-454
Slide 46
Anticuerpos Anti Hormonas Tiroideas
• T4 total : 15,7 ug/dl (5,5-12,5) Quimio DPC
• TSH :
2,47 uUI/ml
• AFM :
1/400
(0,5-5)
“
“
(hasta1/400) Aglutinación
Slide 47
Datos Clínicos
• Mujer. 52 años. Diabética tipo II
• Antecedentes de tratamiento por hipotiroidismo
• Sin tratamiento en los últimos 10 años
• Clínicamente eutiroidea
•
Medicación: metformina
Slide 48
Anticuerpos Anti Hormonas Tiroideas
• T3 : 124 ng/dl
(70-200) Quimio DPC
• T4 total : 14,8 ug/dl
(5,5-12,5) “
• T4 libre : > 6 ng/dl
(0,8-1,9) Análogo 1 paso
• TRH/TSH : 1,9/ 17,2 / 15,2 uUI/ml
“
Slide 49
Anticuerpos Anti Hormonas Tiroideas
• T4 libre (análogo de 1 paso) : > 6 ng/dl (0,8-1,9)
• T4 Libre (eq. de diálisis) : 1,3 ng /dl
(0,8-2,7)
• Inmunoprecipitación con PEG-25% :
(hasta 5%)
45 %
• Diagnóstico: Anticuerpos Anti T4
Slide 50
Anticuerpos Anti Hormonas Tiroideas
• T4 Libre Centaur : Mayor de 12 ng/dl (Un paso)
• TSH
Centaur: 4,52 µUI/ml
• T4 Libre Architect : 1,13 ng/dl
(Dos pasos)
• T4 Libre Centaur – 2º Muestra: 9,0 ng/dl
Slide 51
Slide 52
Principio de Medición de T4 L:
Método Análogo Un Paso
Hormona
Tiroidea
Libre
Separación
y Contéo
+
Proteína Transp.
Análogo
marcado
Anticuerpo
Policlonal unido a
fase sólida
Slide 53
Principio: T4L 2 Pasos
Lavado
1° Paso
2° Paso
Slide 54
Interferencias. Anticuerpos Anti Rhutenio?
Instrum.
TSH
T4 Total
Cortisol
Lab # 1
Cobas
Lab # 2
Cobas
0,56
24,4
30,3
0,48
24,9
T4 L: 1,8
28,2
Lab # 3
Vitros
0,57
10,2
17,2
Slide 55
Interferencias por Auto Anticuerpos
Slide 56
Medición de Tiroglobulina
• La medición de Tg es usada en el seguimiento de
pacientes tratados por Cáncer diferenciado de tiroides
• La presencia de Anticuerpos Anti Tg (~ 25 %)
interfiere en la medición de Tg, limitando su utilidad en
la evaluación de recurrencia
• Resultados falsamente disminuidos en
inmunométricos)
Pacini F, Eur J Nucl Med Mol Imaging 2002; 29: S492-6
Spencer C, JCEM 2004; 3702-4
Slide 57
TgAb Effects on Serum Tg Measurement
H u m an
T g Ab
Tg
B ound Tg
Tg
Free Tg
IM A
M E TH OD S
RIA
M E TH O D S
Slide 58
S e r u m T g C o r r e la tio n s b y R IA v s IM A M e th o d s
T g A b N e g a tiv e S e ra (n = 2 1 1 )
T g A b P o sitiv e S e ra (n = 22 2 )
1 ,0 0 0
1 ,0 0 0
25%
46%
100
100
10
10
Tg
IM A 2
n g /m l 1
73%
48%
0 .5
U n d e te c ta b le
1 2
10
10 0
T g R IA (n g /m l)
1 ,0 0 0
Tg
2 IM A
n g /m l
1
0 .5
U n d e te c ta b le
0 .5 1 2
10
1 00
T g R IA (n g /m l)
Spencer et al. Thyroid 9: 435, 1999
1,00 0
Slide 59
Anticuerpos Anti Tiroglobulina en CDT
Spencer C, JCEM 96:3615-27, 2011
Slide 60
Medición de Anticuerpos Anti
Tiroglobulina
Instrumento
Sensib.
Valor de
Ref.
Architect
0,3
Hasta 4,1
Cobas
10,0
Hasta 115
Immulite
10,0
Hasta 40
Slide 61
Medición de Tiroglobulina por LC-MS/MS
Slide 62
Kushnir M, Clin Chem 2013; 59:6, 1-9
Slide 63
Kushnir M, Clin Chem 2013; 59:6, 1-9
Slide 64
Interferencias Isoformas Atípicas
Hormonas Proteicas-Ig G
Prolactina - - - - PEG
TSH
PTH
Slide 65
Métodos Utilizados para Prolactina
Reconocimiento de Macroprolactina
• Baja Reactividad
• Mediana Reactividad
• Alta Reactividad
Slide 66
Interferencias en los Inmunoensayos
• Reacción cruzada
• Autoanticuerpos
• Anticuerpos Heterófilos/HAMA
• Factor Reumatoideo
Slide 67
Anticuerpos Heterófilos/HAMA
• Son Anticuerpos del isotipo Ig G humanos que
reaccionan contra las Inmunoglobulinas de animal
presentes en los reactivos
• Interfieren en ensayos inmunométricos de diferentes
analitos
• Frecuencia variable : 0.2 - 1.5 %
Slide 68
Anticuerpos Heterófilos
¿Cómo se originan?
• Son anticuerpos humanos de baja afinidad,
producidos previo a la exposición antigénica
• Reaccionan con los reactivos de los ensayos
• Ocasionan resultados generalmente elevados en
ensayos inmunométricos
Slide 69
Anticuerpos Heterófilos - HAMA
¿Cómo se originan?
• Anticuerpos humanos anti ratón
• A través de inmunización por exposición con animales
• En pacientes que reciben infusión de Anticuerpos
monoclonales con fines diagnósticos o terapéuticos
Slide 70
Ensayos Inmunométricos Sistemas IMA
Fase
sólida
Ac. Captura
TSH
Ac. Señal
Señal
Slide 71
Ac. Heterófilo
Fase
sólida
Ac. Captura
Ac. Señal
Señal
Slide 72
Interferencia por Anticuerpos Heterófilos
Estrategias para eliminar la interferencia
Fabricantes :
• Agregado de suero no inmune de origen animal en el
reactivo
• Preparación de Anticuerpos quiméricos humano/animal
En el Laboratorio:
• Preincubación del suero con suero no inmune animal
• Re análisis cambiando marca de reactivo
Slide 73
Interferencia por Anticuerpos
Heterófilos en la medición de TSH
Método 1
Método 2
Método 3
0.81 (<0.1)
<0.1
0.08
1.2 (< 0.1)
<0.1
0.04
1.8 (0.63)
0.78
0.64
2.4 (< 0.1)
< 0.1
0.1
9.2 (1.1)
0.98
2.07(0.63)
Nisbet JA, Clin Chem 1986; 32: 201-2
Slide 74
Interferencia por Anticuerpos Heterófilos en
la medición de TSH Acción de Ig G ratón
Ig G agregada
(ug/l)
0
0.61
1.25
2.50
5.0
20.0
TSH
(mUI/L)
8.7
2.7
1.6
0.9
0.4
< 0.05
Nisbet JA, Clin Chem 1986; 32: 201-2
Slide 75
Interferencias en los Inmunoensayos
• Reacción cruzada
• Autoanticuerpos
• Anticuerpos Heterófilos/HAMA
• Factor Reumatoideo
Slide 76
Factor Reumatoideo
• Son Anticuerpos del isotipo Ig M, con especificidad al
fragmento Fc de Ig G humana
• Exhibe unión no específica a los Acs de los reactivos,
actuando sobre Fc de los mismos
• Alta prevalencia en Artritis Reumatoidea (70 %), y en
otras enfs. Autoinmunes
• La interferencia genera usualmente resultados
falsamente elevados
Slide 77
Métodos para evaluar Interferencias
en el Laboratorio
• Repetir el análisis con un inmunoensayo
alternativo que utilice anticuerpos de diferente
especies
• Realizar la medición antes y después del
agregado de reactivo bloqueante
• Isoformas atípicas (Prolactina), uso de PEG
• Realizar diluciones de la muestra y evaluar
linealidad
Slide 78
Desafíos en el Laboratorio de
Endocrinología
• Evolución de las mediciones hormonales
• Características de los métodos utilizados en
endocrinología
• Interferencias – Limitaciones
Efecto Hook
Situaciones clínicas poco frecuentes
• Variabilidad de resultados
Slide 79
Efecto Hook – Altas
concentraciones
Muy altas concentraciones pueden saturar los reactivos
empleados y arrojar resultados Falsamente disminuidos
en métodos inmunométricos
Estrategias metodológicas de dos pasos pueden reducir
la ocurrencia
Reconocer esta posibilidad, es necesario para poder
realizar diluciones seriadas ante resultados falsamente
bajos
Slide 80
Efecto Hook – Altas concentraciones
Resultados
Falsamente
disminuidos
Slide 81
Condiciones Clínicas Poco Frecuentes
• Alteración en el transporte de Hormonas tiroideas:
Alteraciones Congénitas de TBG
Alteraciones adquiridas de TBG
Hipertiroxinemia Disalbuminémica Familiar
Aumento de Afinidad de Transtiretina
• Cambios en la actividad biológica de TSH
Hipotiroidismo central – Actividad biológica
reducida
Slide 82
TBG Elevada
Esteroides
Sexuales
TBG Disminuida
Estrógenos
Andrógenos
• Embarazo
Esteroides anabólicos
Albúmina/TTR
Embarazo
• Anticonceptivos orales
Drogas
5 Fluorouracilo
Glucocorticoides
Heroína/Metadona
L- Asparaginasa
Clofibrate
Acido Nicotínico
Perfenacina
Enfermedad
Hepatitis aguda/crónica
Enfermedad grave - NTI
Insuficiencia suprarrenal
Síndrome Nefrótico
SIDA
Desnutrición
Porfiria intermitente aguda
Acromegalia
Hipotiroidismo
Síndrome de Cushing
Hipertirodismo
Congénito
Exceso
Deficiencia
NTI
Desnutr.
Afinidad:
Albúmina -FDH
TTR
Bartelena, Horm Res 45: 142 -7, 1996
Slide 83
Déficit completo
Paciente T3 Total T4 Total
ng/dl
ug/dl
T4 L
ng/dl
TSH
UI/ml
TBG
mg/l
1
62
2.2
1.2
0.7
1.0
2
50
2.1
1.5
1.7
1.0
3
35
1.1
1.0
1.1
1.0
2.5
0.95
1.54
< 1.0
4
Slide 84
Deficiencia Parcial
Paciente T3 Total T4 Total T4 Libre
ng/dl
ug/dl
ng/dl
TSH
UI/ml
TBG
mg/l
1
66
4.0
1.3
0.87
4.7
2
44
3.4
1.2
4.0
2.6
3
94
3.7
1.0
0.51
3.3
4
39
3.6
0.90
0.80
12.0
5
74
2.6
0.96
2.69
3.6
6
83
3.7
1.20
3.11
3.0
4.0
0.85
0.51
7.6
7
8
89
4.7
0.75
3.72
11.4
9
86
4.4
0.95
1.58
9.7
10
67
4.6
1.2
1.2
6.6
Slide 85
Exceso Congénito
P acien te
T 3 T o tal
n g /d l
1
T 4 T o tal
u g /d l
T4L
n g /d l
TSH
U I/m l
TBG
m g /l
1 4 .0
1 .1
3 .0
76
2
238
1 3 .6
1 .0
1 1 .6
68
3
310
1 9 .5
1 .2
3 .6 6
89
4
289
1 3 .6
1 .3
4 .3
68
Slide 86
Complete Thyroxine-Binding Globulin
deficiency, due to a novel p.A64D mutation,
associated with increased affinity in
Transthyretin (p.A109T mutation) in an
hypothyroid patient
( ITC2010-1135)
Sklate R, Maccallini G, Olcese M, Agüero M,
Sánchez M, González Sarmiento R, Targovnik H,
Niepomniszcze H, Rivolta C
Slide 87
• A 52-year-old man was referred to us for the
management of his hypothyroidism post
thyroidectomy, 30 years earlier.
•
He had a sister and nieces who were hypothyroid.
• He was treated with 150 μg/day of L-T4 and was
asymptomatic.
Slide 88
Results with Elecsys and Clinical status
L-T4
Doses
150 μg/d
Clinical
status
Euthyroid
TSH (μIU/ml) 0.32
FT4 (ng/dl)
(nr: 0.8-1.7)
3.21
T3 (ng/dl)
(nr: 80-200)
66
Slide 89
Results with Elecsys and Clinical status
L-T4
Doses
150 μg/d
Clinical
status
Euthyroid
Hypothyroid
TSH (μIU/ml)
0.32
>100
FT4 (ng/dl)
(nr: 0.8-1.7)
3.21
<0.1
T3 (ng/dl)
(nr: 80-200)
66
<20
Stopped
Slide 90
Results with Elecsys and Clinical status
L-T4
Doses
150 μg/d
Clinical
status
Euthyroid
Hypothyroid
Euthyroid
TSH (μIU/ml)
0.32
>100
3.37
FT4 (ng/dl)
(nr: 0.8-1.7)
3.21
<0.1
3.05
T3 (ng/dl)
(nr: 80-200)
66
<20
Stopped
125 μg/d
Slide 91
Results with Elecsys and Clinical status
L-T4
Doses
150 μg/d
Clinical
status
Euthyroid
Hypothyroid
Euthyroid
Hypothyroid
TSH (μIU/ml)
0.32
>100
3.37
43
FT4 (ng/dl)
(nr: 0.8-1.7)
3.21
<0.1
3.05
1.55
T3 (ng/dl)
(nr: 80-200)
66
<20
Stopped
125 μg/d 88 μg/d
Slide 92
Results with Elecsys and Clinical status
L-T4
Doses
150 μg/d
Stopped
125 μg/d 88 μg/d
Euthyroid
Hypothyroid Euthyroid Hypothyroid
Clinical
Inappropriate TSH secretion:
status
TSH (μIU/ml) 0.32
>100
Resistance to Thyroid Hormone
or
FT4
<0.1
TSH(ng/dl)
Secreting 3.21
Pituitary Adenoma
(nr: 0.8-1.7)
(Normal Pituitary MRI)
T3 (ng/dl)
66
<20
(nr: 80-200)
3.37
43
3.05
1.55
TBG was < 3 mg/l
(17-27 mg/l)
Anti T4Antibodies
Slide 93
Patient euthyroid under L-T4 125 μg/d
Discordance between TSH and FT4
One step
Elecsys
Immulite
TSH
(μIU/ml)
FT4
(ng/dl)
FT3
(pg/dl)
Total T4
(μg/dl)
Total T3
(ng/dl)
3.37
FT4
(ng/dl)3.05
(0.8-1.7)
Two step
Architect
3.19
4.36
(0.8-1.9)
0.8
(0.7-1.48)
1.42
(1.5-4.1)
4.51
(4.9-11.7)
61
Slide 94
T4-binding protein
radioelectrophoresis
TTR-bound T4 was
significantly increased: 92.6
μg/dl
(nr:48.8–70.4)
TBG-bound T4 was absent
Two abnormalities in binding proteins with
opposite effects
Slide 95
TBG gene
Novel mutation c.251C>A (p.A64D)
Hemizygous
Wild-type allele
GCC
Ala (64)
Mutant allele
GAC
Asp (64)
Slide 96
TTR gene
c.385G>A (p.A109T)
Heterozygous
Wild-type allele
GCC
Ala (109)
Mutant allele
ACC
Thr (109)
Slide 97
Conclusions
The combination of two different alterations in binding
proteins, with opposite effects, was the cause of the
discordance between thyroid function test results and clinical
outcome in a male patient without thyroid gland and a
previous history of hyperthyroidism.
Taking into account that a brother had also no detectable TBG
and a sister had low TBG level, these familiar findings lead us to
diagnose an inherited complete TBG deficiency.
This is the first time that simultaneous mutations in these T4binding proteins are reported in the literature. Moreover, one
of them is a novel mutation in the TBG gene producing a lack
of this protein.
Slide 98
Principio de Medición de T4 L:
Método Análogo Un Paso
Hormona
Tiroidea
Libre
Separación
y Contéo
+
Proteína Transp.
Análogo
marcado
Anticuerpo
Policlonal unido a
fase sólida
Slide 99
Principio de Medición de T4 L:
Método Análogo Un Paso
Hormona
Tiroidea
Libre
Separación
y Contéo
+
Proteína Transp.
Análogo
marcado
Anticuerpo
Policlonal unido a
fase sólida
Slide 100
Principio de Medición de T4L por
Método de 2 Pasos
Lavado
1° Paso
2° Paso
Slide 101
Principio de Medición de T4L por
Método de 2 Pasos
Lavado
1° Paso
2° Paso
Slide 102
Condiciones Clínicas Poco Frecuentes
• Alteración en el transporte de Hormonas tiroideas:
Alteraciones Congénitas de TBG
Alteraciones adquiridas de TBG
Hipertiroxinemia Disalbuminémica Familiar
Aumento de Afinidad de Transtiretina
• Cambios en la actividad biológica de TSH
Hipotiroidismo central – Actividad biológica
reducida
Slide 103
Slide 104
Desafíos en el Laboratorio de
Endocrinología
• Evolución de las mediciones hormonales
• Características de los métodos utilizados en
endocrinología
• Interferencias – Limitaciones
• Variabilidad de resultados
Slide 105
Composición de un resultado de
laboratorio
Valor
verdadero
Resultado de la muestra
Variabilidad Pre-analítica
(estimada como irrelevante)
Variabilidad analítica
(imprecisión analítica total)
Bias Analítico
Variabilidad Biológica Intrínseca
(una constante)
VARIABILIDAD TOTAL
Variabilidad Analítica
(imprecisión analítica total)
+ Bias Analítico
= ERROR TOTAL
Slide 106
Tipos de Errores en la Medición
Valor
Verdadero
Incremento en
error aleatorio
Desvío sistemático
Desempeño
analítico estable
Tamaño del error
0
Tamaño del error
Slide 107
05
Ab
r-0
6
Ag
o06
Di
c0
Ab 6
r-0
7
Ag
o07
Di
c0
Ab 7
r-0
8
Ag
o08
Di
c0
Ab 8
r-0
9
Ag
o09
Di
c0
Ab 9
r-1
0
Ag
o10
Di
c10
Ab
r-1
1
Ag
o11
Di
c11
Ab
r-1
2
Di
c-
CV % Mensual
Control de Calidad Interno para TSH-Imprecisión.
14
12
10
Req. V.B. Deseable
8
6
4
Nivel 1
2
0
Nivel 2
Nivel 3
Slide 108
Variabilidad Biológica
Slide 109
Las determinaciones tiroideas tienen estrecha variabilidad
intra-individual con respecto a valores de referencia
TSH
Sujetos individuales
Tiroglobulina
T4 Libre
Sujetos individuales
Sujetos individuales
Variabilidad individual (un año)
Jensen CCLM 45:1058, 2007
Andersen JCEM 87:1068, 2002
Valores de Referencia poblacionales
Slide 110
Variabilidad Biológica y Valores de
Referencia
Las determinaciones de la función tiroidea tienen una
Variabilidad intra-individual baja en relación a la
Variabilidad inter-individual
Indice de Individualidad Bajo
Valores de Referencia específicos por paciente
Slide 111
Slide 112
• Reporte de Resultados – Intervalos de Referencia adecuados –
Evaluación inicial
• Para monitoreo de resultados. Cambios y Respuesta a
tratamientos – (Indices de Individualidad bajos)
Mínimo cambio significativo
VRC = 1.96 . √2 . √(CVI 2 + CVA 2)
CvI = Variabilidad biológica Intraindividual
CVA = Variabilidad Analítica
Mínima diferencia entre dos resultados sucesivos en un
individuo que puede ser considerado para reflejar un cambio
real
Slide 113
Informe de Laboratorio - Resultados
Valor de Referencia para el Cambio/ Delta Check
Significancia clínica de cambio en 2 resultados
consecutivos de un individuo, implica tomar
consideraciones tanto de variación fisiológica como
analíticas
• CVI:
• CVA:
Coeficiente de variación intra- individual
Coeficiente de variación analítico
Slide 114
Informe de Laboratorio - Resultados
Valor de Referencia para el Cambio/ Delta Check
Diferencia entre un resultado de laboratorio actual de
un paciente y el resultado previo que excede un límite
predefinido
• Cambio Significativo *
* Cambio si > VRC = 1.96 . √2 . √(CVI 2 + CVA 2)
*Este resultado difiere significativamente del valor previo
Fraser CG, Crit Rev Clin Lab Sci 1989; 27: 409-37
Slide 115
Slide 116
Slide 117
Slide 118
Slide 119
Desafíos en el Laboratorio Endocrinológico
Tratamiento
Inapropiado
Resultado
Incorrecto
Paciente - Médico
Laboratorio
Condiciones Clínicas
Poco Frecuentes
• Cambios en el
transporte de HT.
• Hipot. Central
• Resistencia a HT
•
•
•
•
Tratamiento
Apropiado
Resultado
Correcto
Interferencias
Autoanticuerpos
Alteración Proteínas
Anticuerpos
Heterófilos/HAMA/FR
Reacción cruzada
Limitaciones
Efecto Hook
Control a Cargo del Lab
Control Preánalìtico,
Analìtico y Post Analìtico
Slide 120
Muchas gracias
por su atención.