Slide 1

‫אמינות הבדיקות לחומרים‬
‫אנטיביוטיים בחלב‬
‫סקירת מאמר‬
‫ד"ר עומר קליין‬
‫החקלאית‬


Slide 2

Reliability of three bulk-tank antimicrobial residue detection assays
used to test individual milk
samples from cows with mild
clinical mastitis.
Suzanne N. Gibbons-Burgener, John B. Kaneene, James W.
Lloyd, Joseph A. Leykam, Roland J. Erskine

AJVR ‫ במגזין‬2001-‫פורסם ב‬
‫צוות חוקרים מאוניברסיטת מישיגן‬
2008 ‫חומרים מעכבים‬


Slide 3

‫מבוא‬
‫המטרה‪ :‬שיווק חלב בריא‪ ,‬ללא חומרים אסורים‪.‬‬
‫"שארית כימיות" ‪ -‬חומר הדברה‪ ,‬חומר אורגני‪ ,‬חומר לא אורגני‪ ,‬חומר‬
‫מתכתי‪ ,‬הורמונים‪ ,‬אנטיביוטיקה‪ ,‬חומרים אנטימיקרוביאליים אחרים‪ ,‬חומרי‬
‫תילוע‪ ,‬חומרים מרגיעים או כל חומר אחר‪ ,‬לרבות נגזרותיו‪ ,‬המשאיר שאריות‬
‫בבעל חיים בעת המתתו או לאחריה‪ ,‬באחת מן הרקמות או האברים שלו או‬

‫בתוצרתו‪.‬‬
‫תרופה תאושר לשימוש בחיות נחלבות רק במידה וקיימת‬
‫שיטה לאיתור החומר בחלב משווק‪.‬‬
‫לכל חומר רמה מרבית (גבוהה מאפס) מותרת לשיווק‪.‬‬
‫חומרים מעכבים ‪2008‬‬


Slide 4

‫מטרת המחקר‬
‫קביעת רגישות‪ ,‬סגוליות ו‪ PPV-‬עבור שלושה‬
‫מבחנים שונים (המיועדים לבדיקת חלב ממספר‬
‫פרות) בבדיקה של חלב מפרה יחידה‪.‬‬
‫)‪Penzyme milk test (enzymatic colorimetric‬‬
‫)‪SNAP b-lactam (enzyme linked receptor‬‬
‫)‪Delvo- SP (microbial growth inhibition‬‬

‫חומרים מעכבים ‪2008‬‬


Slide 5

‫איך עובד ‪Delvo-SP‬‬
‫כל אמפולה מכילה ספורות של ‪B.‬‬
‫‪. Stearothermophilus‬‬

‫מוסיפים לאמפולה חומר מזון‪ ,‬ומחממים‪.‬‬
‫גדילת הספורות יוצרת חומצה‪.‬‬
‫מביא לשינוי צבע המצע מסגול לצהוב‪.‬‬
‫נוכחות חומר מעכב תמנע גדילה של החיידקים‪,‬‬
‫וכתוצאה מכך‪ ,‬תמנע שינוי צבע‪.‬‬
‫חומרים מעכבים ‪2008‬‬


Slide 6

‫שיטות וחומרים‬
‫הגדרת מקרה‪ :‬פרה עם דלקת עטין מתונה‪ .‬טיפול‬
‫אנטיביוטי תוך עטיני בלבד‪.‬‬
‫הוצאו מהמחקר‪ :‬טיפול אנטיביוטי סיסטמי‪ ,‬טיפול‬
‫אנטיביוטי ב‪ 30-‬הימים לפני הבדיקה‪.‬‬
‫סה"כ ‪ 111‬נכנסו לניסוי‪ 92 ,‬נשארו‪.‬‬

‫חומרים מעכבים ‪2008‬‬


Slide 7

‫שיטות וחומרים‬
‫קבוצות טיפול‪:‬‬
‫חלוקה אקראית לקבוצת ביקורת ‪)51%( 47/92‬‬
‫קבוצת טיפול ‪)49%( 45/92‬‬
‫מתוך מקבלות הטיפול‪:‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬

‫‪ 26‬קיבלו ‪Pirlimycin‬‬
‫‪ 10‬קיבלו ‪Cephapirin‬‬
‫‪ 9‬קיבלו ‪Hetacillin‬‬

‫חלק מהפרות קיבלו גם תרופות נוספות(‪.)NSAIDs‬‬
‫חומרים מעכבים ‪2008‬‬


Slide 8

‫שיטות וחומרים‬
‫דוגמאות ובדיקות‪:‬‬
‫לכל פרה נאספה דוגמת חלב אחת לפני הטיפול‪,‬‬
‫ודוגמא נוספת לאחר תקופת ההמתנה מסיום‬
‫הטיפול‪.‬‬
‫הדוגמאות נבדקו ע"י בודק "עיוור"‪.‬‬
‫כל דוגמא נבדקה פעמיים בכל מבחן‪.‬‬
‫כל דוגמא נבדקה פעם אחת ע"י ‪ ,HPLC‬המהווה‬
‫מבחן בעל אמינות מקסימלית‪.‬‬
‫)‪(High performance liquid chromatography‬‬
‫חומרים מעכבים ‪2008‬‬


Slide 9

‫הסבר סטטיסטי קצר‬
‫פירוט של מדדים שונים המתייחסים ליכולות של בדיקה‬
‫(מבחן) מסוימת לתאר את המצב האמיתי‪:‬‬
‫רגישות )‪ :(Sensitivity‬כמה מבין החיוביים במציאות‬
‫יהיו חיוביים ע"י הבדיקה‪.‬‬
‫סגוליות )‪ :(Specificity‬כמה מבין השליליים במציאות‬
‫יהיו שליליים ע"י הבדיקה‪.‬‬
‫ערך מנבא חיובי )‪PPV (Positive predictive value‬‬
‫כמה מבין החיוביים במבחן אכן חיוביים במציאות‪.‬‬
‫ערך מנבא שלילי )‪NPV (Negative predictive value‬‬
‫כמה מבין השליליים במבחן אכן שליליים במציאות‪.‬‬
‫חומרים מעכבים ‪2008‬‬


Slide 10

‫תוצאות‬
‫השוואת תוצאות ‪ Delvo-SP‬ל‪ HPLC-‬מעל סף‬
‫גילוי של המבחן‬
‫‪HPLC‬‬
‫רגישות ‪90.3%‬‬
‫סגוליות ‪93.2%‬‬
‫‪Delvo-SP‬‬
‫‪97.8% NPV‬‬
‫‪73.7% PPV‬‬

‫חומרים מעכבים ‪2008‬‬


Slide 11

‫תוצאות‬
‫השוואת תוצאות ‪ Delvo-SP‬ל‪ HPLC-‬מעל רמה מותרת‬
‫בחלב ע"י ‪FDA‬‬
‫‪HPLC‬‬
‫רגישות ‪91.7%‬‬
‫סגוליות ‪84.7%‬‬
‫‪Delvo-SP‬‬
‫‪99.3% NPV‬‬

‫‪30.6% PPV‬‬

‫שימו לב לירידה המשמעותית ב‪PPV -‬‬
‫משמעות‪ :‬מסך כל הבדיקות החיוביות ב‪-‬‬
‫‪ Delvotest‬ב‪ 70%-‬נשפוך חלב מותר לשיווק‪.‬‬
‫חומרים מעכבים ‪2008‬‬


Slide 12

‫תוצאות‬
‫השוואת תוצאות ‪ SNAP b-lactam‬ל‪ HPLC-‬מעל‬
‫סף גילוי‬
‫‪HPLC‬‬
‫• רגישות ‪91.7%‬‬
‫‪SNAP b-lac‬‬
‫• סגוליות ‪89.1%‬‬
‫• ‪39.3% PPV‬‬
‫• במבחן זה הרגישות והסגוליות דומים למבחן‬
‫‪ Delvo‬אבל ה ‪PPV‬נמוך מאד‪.‬‬
‫חומרים מעכבים ‪2008‬‬


Slide 13

‫תוצאות‬
‫השוואת תוצאות ‪ SNAP b-lactam‬ל‪ HPLC-‬מעל‬
‫רמה מותרת בחלב ע"י ‪FDA‬‬
‫‪HPLC‬‬
‫• רגישות ‪83.3%‬‬
‫• סגוליות ‪88.0%‬‬
‫‪SNAP b-lac‬‬
‫• ‪20.8% PPV‬‬

‫חומרים מעכבים ‪2008‬‬


Slide 14

‫סיכום תוצאות‬
‫‪ 6/45‬פרות הראו רמת אנטיביוטיקה גבוהה‬
‫מהמותר לאחר תקופת ההמתנה המצוינת ע"י‬
‫היצרן‪.‬‬
‫‪ 17/45‬פרות הראו תוצאה חיובית באחד המבחנים‬
‫למרות שרמת האנטיביוטיקה בחלב הייתה תקינה‪.‬‬
‫האם כדאי להסתמך על תוצאות ‪Delvo-SP‬‬
‫למרות ‪ PPV‬נמוך???‬
‫חומרים מעכבים ‪2008‬‬


Slide 15

‫ביקורת על המאמר‬
‫קבוצת ביקורת מיותרת‪.‬‬
‫"הגדלת" המדגם ע"י בדיקה כפולה של הדגימות‪.‬‬
‫ריבוי טיפולים‪ -‬אי התאמה בין חומר טיפול‬
‫לבדיקות‪.‬‬
‫חוסר התייחסות לטיפול משלים‪.‬‬

‫חומרים מעכבים ‪2008‬‬


Slide 16

Delvo-‫מדוע יש כל כך הרבה חיוביים ב‬
: 1 ‫שאינם חיוביים באמת? הסבר‬
‫חומר‬

‫סף גילוי‬
Delvo-SP
(ppb)

Penicillin
2
Amoxicillin
2
Cephapirin
5
Sulfadiazine
50
Gentamicin
100-300
Pirlimycin
50-200
Oxytetracycline
100
2008 ‫חומרים מעכבים‬

‫רמה מירבית‬
‫מותרת‬
(ppb)
4
4
60
100
30
100
100


Slide 17

‫מדוע יש כל כך הרבה חיוביים ב‪Delvo-‬‬
‫שאינם חיוביים באמת? הסבר ‪:2‬‬
‫חלב נורמלי מכיל מעכבים טבעיים‪:‬‬
‫‪Lactoferrin ‬‬
‫‪Lysozyme ‬‬

‫חימום חלב ל ‪ 82‬מ"צ הוריד רמה של ‪False‬‬
‫‪(Kang et al. JDS 2005) positives‬‬
‫קולוסטרום וחלב מעטין עם דלקת‪ ,‬מכילים רמת‬
‫מעכבים גבוהה‪( .‬אסור לבדיקה ע"פ יצרן ‪)Delvo‬‬
‫חומרים מעכבים ‪2008‬‬


Slide 18

‫סיכום‬
‫מבחן ‪ Delvotest‬מזהה שאריות אנטיביוטיקה ומונע שיווק של‬
‫חלב אסור‪ ,‬ופסילה של מיכל חלב שלם‪.‬‬
‫המבחן מיועד לשימוש על חלב מעורבב ממספר פרות‪.‬‬
‫בדיקה של פרה יחידה נותנת תוצאה חיובית שגויה‬
‫)‪ (False positive‬באחוזים גבוהים מאד (‪.)69.3%‬‬
‫הסיבות לכך הן שהמבחן מזהה ברגישות גבוהה מאד חלק‬
‫מהאנטיביוטיקות‪ ,‬וכן בגלל מעכבים טבעיים בחלב‪.‬‬
‫אין כיום מבחן אלטרנטיבי מוצלח יותר‪ ,‬לשימוש מיידי במשק‪.‬‬
‫יתכן וניתן לצמצם ‪ False positives‬וע"י כך שפיכת חלב מיותרת‬
‫ע"י‪ :‬א) חימום הדוגמא לפני הבדיקה‬
‫ב) מהילת הדוגמא הנבדקת‪.‬‬
‫יש צורך בבדיקת ההצעות הנ"ל בצורה מדעית לפני שניתן יהיה‬
‫ליישם אותן‪.‬‬
‫חומרים מעכבים ‪2008‬‬