Transcript OOCYTY MYSZY STOPNIOWO ROZWIJAJĄ ZDOLNOŚĆ DO AKTYWACJI W CZASIE BLOKU METAFAZY II Jacek Z.

OOCYTY MYSZY STOPNIOWO
ROZWIJAJĄ ZDOLNOŚĆ DO
AKTYWACJI W CZASIE
BLOKU METAFAZY II
Jacek Z. Kubiak
W normalnych warunkach dojrzałe oocyty są zapładniane
w czasie bloku metafazy II (MII).
Wniknięcie plemnika powoduje ukończenie II podziału
mejotycznego, wyrzucenie II c.k. i przejście do interfazy.
Niedojrzałe oocyty nie są zdolne do aktywacji przez
wniknięcie plemnika. Jądro plemnika nie tworzy wtedy
przedjądrza, jego DNA tworzy grupki silnie skondensowanej
chromatyny.
Wniknięcie plemnika w czasie prometafazy lub metafazy I
prowadzi do powstania skondensowanych chromosomów z
jądra plemnika
Zachowanie chromatyny oocytu i plemnika po wniknięciu w
M I zależy od liczby plemników:
a) Monospermia lub oligospermia może opóźnić dojrzewanie,
ale prawie nie wpływa efekt końcowy: silnie skondensowane
chromosomy oocytu i plemnika
b) Wysoka polispermia powoduje najczęściej przejście do
iterfazy
c) 4-6 plemników daje efekt pośredni (zwykle blokada w MI,
chromosomy oocytu skondensowane, jądro plemnika nie
tworzy chromosomów)
Oocyty w Metafazie I mogą być zatrzymane w interfazie
przez puromycynę lub cykloheximid (inhibitory syntezy białek)
Inhibicja syntezy białek w M II prowadzi do aktywacji
partenogenetycznej
Pokazanie, że:
 oocyty stopniowo osiągają zdolność do aktywacji w
czasie bloku M II
 dojrzewanie jądra i cytoplazmy to 2 osobne procesy
 czas nabycia zdolności do aktywacji zależy od
czynnika pobudzającego oocyt
Otrzymanie oocytów zatrzymanych w MII:
Myszy
(pokolenie F1 krzyżówki CBA/H*C57Bl/10)
Zastrzyk z PMSG
48-52 godz.
Zastrzyk z HCG
10-10,5 godz.
powyżej 11 godz.
Wykłuwanie oocytów z jajników
Wydobycie oocytów z jajowodów
Pożywka M2+BSA
Hialuronidaza (usunięcie komórek pęcherzykowych)
Usunięcie osłonki przejrzystej (kwaśny roztwór Tyrode’a,
-chymotrypsyna lub 0,5% pronaza)
Usunięcie I c.k. (delikatne pipetowanie)
Dojrzewanie in vitro:
Wykłucie oocytów z
pęcherzyków jajnikowych 4tygodniowych myszy z F1
Hodowla w pożywce Witttena
pod płynną parafiną
(37ºC, 5%CO2)
Aktywacja
partenogenetyczna:
Działanie roztworem 8%
etanolu (6,5 min)
Płukanie w pożywce M2
Hodowla w pożywce M2 pod
płynną parafiną (37ºC, 5%CO2)
Zapłodnienie in vitro:
Otrzymanie plemników z 4-5-miesięcznych samców F1
Kapacytacja (1 godz. W pożywce Whittinghama, pod płynną
parafiną; 37ºC, 5%CO2)
Rozcieńczenie zawiesiny plemników (106 plemników/ml)
Wymieszanie z oocytami pozbawionymi osłonki przejrzystej
(10 min.; dla polispermii zwiększenie koncentracji plemników
lub dłuższy czas inkubacji)
Hodowla w pożywce M2 pod
płynną parafiną (37ºC, 5%CO2)
Z oocytów wykonywano białkowe preparaty totalne barwione
hematoksyliną i suszone preparaty barwione barwnikiem Giemzy
Oocyty używane w doświadczeniach były poddawane
aktywacji w czasie od 11 do 21,5 godzin po
wstrzyknięciu HCG
In vivo oocyty są zapładniane między 13 a 18
godziną
 Czas aktywacji w przeprowadzonych
doświadczeniach zawiera cały naturalny okres
zapłodnienia
Aktywacja partenogenetyczna
Preparaty z oocytów wykonywano 5-7 godzin po aktywacji
etanolem (czas wystarczający, aby oocyty utworzyły przedjądrza)
Rys. 1 (lewa strona) Typy reakcji
oocytów na aktywację partenogenetyczną: pozostanie w MII; stadium
„MIII” – płytka metafazalna utworzona
przez pojedyncze chromatydy (kilka płytek
zawierało nieprawidłową liczbę chromatyd
– hipohaploidalne lub hiperhaploidalne);
niektóre oocyty wciągnęły IIc.k. 2-3 godz.
po wyrzuceniu („stadium 40 chromatyd);
stadium jąder telofazowych (gęste
skupienia chromatyny w oocycie i II c.k.);
stadium jądra retikularnego; stadium
przedjądrza (prawidłowe przejście do
interfazy)
Rys. 2 Nieprawidłowe reakcje
oocytów na bodziec partenogenetyczny: A) Oocyt w stadium M
III (preparat totalny); B) Oocyt
MIII: 20 pojedynczych
chromatyd (preparat suszony);
C)stadium 40 chromatyd
(preparat suszony); D)Stadium
jądra telofazowego: wyraźnie
wybarwione grupy chromatyny w
oocycie i II c.k. (preparat
totalny); E) Oocyt MII: każdy
chromosom składa się z 2
chromatyd
Rys. Stadium
przedjądrzy
Wiek
Typy reakcji (% oocytów))
oocytów po M II Stadium M III Jądro
Jądro
Stadium
wstrzyknięciu
40
telofa retikular przedjąd
HCG
chromazowe
ne
rzy
tyd
Całkowita
liczba
oocytów
11
57,6
1,7
35,6
1,7
-
3,4
59
13
3,6
1,3
48,2
1,3
-
45,6
224
16
1,9
-
7,6
13,3
7,7
69,5
105
17,5
-
1,8
3,5
5,4
1,8
87,5
56
21,5
-
-
-
-
-
100
91
Tab. 1 Typy odpowiedzi oocytów na partenogenetyczną aktywację w
zależności od wieku oocytów po wstrzyknięciu HCG
Częstość pojawiania się danej reakcji oocytu zależała od czasu,
jaki minął od zastrzyku HCG
 Zdolność oocytów do prawidłowej aktywacji partenogenetycznej
jest uzyskiwana stopniowo w czasie bloku M II
 Po 17,5 godzinach ciągle istotna część oocytów (12,5 %) reaguje
nieprawidłowo
Zapłodnienie in vitro
Oocyty zapładniane in vitro między 13 a 17 godziną tworzą
przedjądrza
W doświadczeniu badano zachowanie oocytów zapładnianych
między 11 a 13 godziną
Rys. 1 (prawa strona) Typy reakcji
oocytów na pobudzenie przez plemnik:
pozostanie w M II (brak reakcji); M III
(wyrzucenie II c.k. i zatrzymanie w
metafazie); stadium jądra telofazowego;
stadium przedjądrzy
Brak stadium 40 chromatyd i stadium
jądra retikularnego.
Nieprawidłowa reakcja tylko w
przypadku aktywacji po 11 i 12
godzinach; aktywacja od 13 godziny
powodowała normalną aktywację oocytu
Rys 3. (A-C) Chromatyna w oocytach myszy zapłodnionych na początku
bloku M II (preparaty suszone); A) Chromosomy plemnika przypominające
profazę 6 godzin po zapłodnieniu, w oocycie widać było też chromatydy
stadium M III; B) 2 grupy chromosomów 8 godzin po zapłodnieniu (reakcja
oocytu: M III); C) Dispermia; reakcja oocytu (8 godz. po zapłodnieniu):
widać 3 skupienia chromatyny wewnątrz oocytu.
Wiek
oocytów (po
wstrzyknięciu
HCG)
Typy reakcji (% oocytów)
Całkowita
liczba
oocytów
M II
M III
Stadium jądra
telofazowego
Stadium
przedjądrzy
11
15,6
18,8
-
65,6
32
12
-
6,9
6,9
86,2
29
13
-
-
-
100
35
11
5,9
11,8
-
82,3
17
12
-
-
-
100
4
13
-
-
-
100
22
Monospermia
Dispermia
Tab. 2 Typy reakcji oocytów na zapłodnienie in vitro w różnym czasie
po zastrzyku z HCG
Reakcje oocytów na wniknięcie różnej liczby plemników
Monospermia: w przeciwieństwie do aktywacji
partenogenetycznej, już w 11 godzinie po wstrzyknięciu HCG
większość oocytów zareagowała prawidłowo; po 12 godzinach
wzrosła liczba prawidłowo reagujących oocytów
Dispermia: tylko w 11 godzinie pojawiły się nieprawidłowe
reakcje
Polispermia: badano tylko reakcje oocytów zapładnianych w 11
godzinie po wstrzyknięciu HCG. Z 57 oocytów tylko 1 nie przeszedł
do interfazy (nie utworzył przedjądrzy): trispermia – oocyt
zatrzymał się w M III, pozostałe trispermie – powstały
przedjądrza. Powyżej 5 plemników:powstawało tylko 1
przedjądrze,pozostałe jądra plemników zablokowane w rozwoju
(chromatyna pozostała skupiona)
 Oocyty stopniowo uzyskują zdolność do aktywacji
 Różne bodźce mają różną siłę: polispermia jest mocniejszym
sygnałem niż monospermia, a monospermia niż aktywacja alkoholowa
Stadium M III
Stadium to jest osiągane, kiedy oocyt jest w stanie wyjść z bloku M
II i ukończyć podział, ale nie jest w stanie przejść do interfazy
Po 2-3 godzinach od wyrzucenia II c.k., odpada ono bardzo łatwo
od oocytu
Czy blok M III jest podobny do M II? Doświadczenia:
1. 43 oocyty oocyty zatrzymane w M III poddano ponownemu działaniu
etanolu 8% 2,5-4 godz. po pierwszej aktywacji. Większość (40
oocytów nie zareagowała: pozostała w M III), 2 utworzyły
przedjądrza, a 1 zatrzymał się w M IV.
2. Oocyty zatrzymane w M II (traktowane etanolem 14 godz. po
wstrzyknięciu HCG) 5 godzin później ponownie poddano działaniu
etanolem. Większość (78%) pozostała w MII, pozostałe przeszły w
stadia: MIII, jądro retikularne, jądro telofazowe, przedjądrza. W
kontroli (oocyty 19 godz. po zastrzyku z HCG, bez wcześniejszego
traktowania etanolem) większość (88,4%) utworzyła przedjądrza.
 Ponowne działanie etanolem jest mało wydajne: zarówno oocyty
zatrzymane w M II jak i w M III w większości przypadków
pozostają zablokowane.
Doświadczenia:
3. Oocyty w M III poddano działaniu innego czynnika
partenogenetycznego: puromycyny. Z 10 oocytów, 9 przeszło do
interfazy.
4. Oocyty w M III poddano zapłodnieniu in vitro. Wszystkie
oocyty, do których wniknął plemnik wyrzuciły III c.k.; jądra
plemników uległy dekondensacji. 4 oocyty poddano działaniu
kolcemidu przez noc: w 3 przedjądrza uległy rozpadowi.
Rys 3. (D,E) Wniknięcie plemnika
spowodowało wyrzucenie II
c.k.Oocyty były hodowane przez
noc w obecności kolcemidu
(preparaty suszone) D) Po lewej: 9 chromosomów pochodzących z aneuploidalnego
przedjądrza żeńskiego (wywodzącego się z M III); po prawej: grupa chromosomów
profazowych przedjądrza męskiego; E) po lewej:8 chromosomów aneuploidalnego
przedjądrza żeńskiego; po prawej: chromosomy przedjądrza męskiego
 Blok M III jest podobny do bloku M II i może być zwolniony po
wniknięciu plemnika. Aktywacja oocytów M III powoduje rozpoczęcie
ruchów anafazowych i wyrzucenie III c.k.
Oocyty myszy stopniowo uzyskują zdolność do aktywacji w trakcie bloku
M II.
Doświadczenia pokazują, że ruchy anafazowe i dekondensacja
chromosomów to dwa niezależne procesy: w obecności kolcemidu (brak
wrzeciona podziałowego) oocyty są w stanie przejść do interfazy; w
oocytach zatrzymanych w M III zaszły ruchy anafazowe, ale
chromatyna nie przeszła do stadium interfazy
Autor zastanawia się nad rolą oscylacji stężenia jonów Ca2+ w
dojrzewaniu oocytów (wyjściu z bloku M II). Obecnie znany jest szlak
przekaźnictwa prowadzący do wzrostu stężenia jonów Ca2+, jony te
przyczyniają się do rozpadu MPF. Rys.  Rola IP3 w uwolnieniu jonów Ca2+;
Regulacja cyklu komórkowego w czasie
mejozy
Mechanizm ruchu chromosomów w czasie wyjścia z M III jest
nietypowy: pojedyncze chromatydy nie mogą już być rozdzielone tak jak
normalne chromosomy.
Nietypowe jest łatwe odpadanie II c.k. w M III. Zwykle II c.k.
pozostaje silnie związane z oocytem (rola midbody). Tutaj II c.k.
zachowuje się jak I c.k. w normalnej mejozie.
Oocyty w 13 godzinie są w pełni zdolne do aktywacji przez plemnik,
w przeciwieństwie do działania 8% etanolem. Zdolność oocytu do reakcji
zależy od rodzaju bodźca aktywującego.
U myszy w oocytach pozostających w M II lub M III chromatyna
tylko 1 plemnika tworzy chromosomy.
Dojrzewanie cytoplazmatyczne i jądrowe to 2 różne procesy.
Oocyty w M I mogą być aktywowane partenogenetycznie: traktowane
najpierw puromycyną, potem dbcAMP