Transcript Vje*ba 4. Immunoblot (detekcija)

Vježba 10, 11 i 12. Elektroforeza
proteina, Western blot (WB),
imunofluorescencija (IF),
imunohistokemija (ICH)
SDS-PAGE
Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
Merkaptoetanol denaturira protein, kida disulfidne veze
svi proteini imaju isti omjer naboja i mase
aminokiselina:SDS = 2:1
Manji proteini brže putuju kroz gel
uzorak
katoda
Smjesa
makromolekula
gel
anoda
pufer
Proteinski
marker
Vizualizacija proteina u gelu
• Coomassie brilliant blue
• Bojanje srebrom
Protein
marker
BSA
20 µg 10 µg 5 µg 2 µg
Transfer proteina na membranu
• Nitrocelulozna membrana
• PVDF (poliviniliden difluorid) membrana
WESTERN BLOT
1. PonceauS reverzibilno BOJANJE
membrane
2. BLOKIRANJE membrane u puferu sa
5%BSA (Bovine serum albumin)
3. Inkubacija s PRIMARNIM
ANTITIJELOM preko noći
4. ISPIRANJE membrane u TBS Tween20 puferu (Tris Buffered Saline)
5. Inkubacija s SEKUNDARNIM
ANTITIJELOM
6. ISPIRANJE membrane u TBS Tween20 puferu
7. Inkubacija s ILUMINOGENIM
supstratom za peroksidazu hrena
(HRP)
8. VIZUALIZACIJA (svjetlosni signal na
fotopapiru)
PonceauS
Imunodetekcija
IMUNOKEMIJSKE METODE
• temelje se na specifičnoj reakciji antigen-protutijelo i stvaranju kompleksa
Ag-Ab
PRIMJENA IMUNOKEMIJSKIH METODA
• detekcija proteina nakon elektroforeze u gelovima i na membranama
nakon prijenosa (Western blotting)
• detekcija antigena na prerezima tkiva (mikroskopija)
• detekcija antigena na stanicama (protočna citometrija)
• kvantitativno određivanje antigena u otopinama (RIA, EIA, ELISA)
PROTUTIJELA (antitijela) su glikoproteini
(imunoglobulini) sintetizirani kao odgovor organizma
na prisustvo stranih tvari, antigena. Luče ih plazma
stanice koje poticu od B limfocita.
- osnovna jedinica imunoglobulina je sastavljena
od 4 lanca, dva duža (teški lanci) i dva kraca (laki
lanci).
At i Ab vežu se slično kao enzim i supstrat stvaranjem
slabih veza.
Aminokiseline koje tvore aktivno mjesto nalazi se na
varijabilnim dijelovima lakih i teških lanaca.
EPITOP – dio antigena koji prepoznaje imunološki
sustav
Priprema antitijela za western blotting
•
primarna antitijela
• POLIKLONSKA antitijela - antitijela se proizvode
imunizacijom životinje (obično kunića ili miša) sa
pročišćenim proteinom od interesa, te se izoliraju iz
seruma životinje
• MONOKLONSKA antitijela - hibridomi
•
Sekundarna antitijela - u većoj životinji (kozi, ovci ili svinji)
komercijalno se proizvode obilježena antitijela koja specifično
reagiraju s antitijelima kunića ili miša (npr. kozja antikunićja
antitijela)
PROIZVODNJA MONOKLONALNIH ANTITIJELA
http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/monoclonalantibodies.html
PROIZVODNJA POLIKLONALNIH ANTITIJELA
OBILJEŽAVANJE PROTUTIJELA
• Fluorogeni spojevi, fluorofori (fluorescein, rodamin, fikoeritrin)
• Radioaktivni izotopi, radionuklidi (jod125, H3)
• Enzimi: peroksidaza iz hrena (HRP), alkalna fosfataza
DETEKCIJA
• Fluorescencija (produkt koji fluorescira)
• Kolorimetrija (obojen i netopiv produkt – denzitometrija, obojen produkt mjerljiv u
vodi – fotometrija)
• Luminiscencija (fotoni svjetlosti, bioluminiscencija, kemiluminiscencija)
Bioluminescencija: oksidacija luceferina pomocu luciferaze, enzima iz krijesnica, uz
utrošak ATP
Kemiluminiscencija: Oksidacijom luminola, uz prisutnosti vodikovog peroksida, nastaje 3aminoftalat, koji je ekscitiran i prelaskom u niže energetsko stanje emitira fotone
svjetlosti koji se detektiraju pomoću fotografskog filma.
SDS PAGE http://www.youtube.com/watch?v=toPpdoBYPWo
Western blot: http://www.youtube.com/watch?v=pRIn3p7x3V8
Imunofluorescencija: http://www.youtube.com/watch?v=pteO6FRWo3g
Imunohistokemija: http://www.youtube.com/watch?v=HdBgTAAi3rU