Transcript preuzmi prezentaciju

Analiza distrofina Western blot
metodom u diferencijalnoj dijagnozi
Duchenen-ove i Becker-ove
mišićne distrofije
Mr. Sci. Amina Valjevac
Distrofin
 Citoskeletni protein velike mol mase - 427kDa
 unutrašnja strana sarkoleme
 Povezuje aktin sa ekstracelularnim matriksom
 Skeletni i srčani mišić
 Glatka mišićna vlakna
 Mrežnica
 CNS
Distrofin
 Dio proteinskog kompleksa stanične membrane
(DAGC)
 DAGC transmembranski protein koji povezuje
citoskelet (F- aktin) i ekstracelularni matriks (merozin)
Distrofin
 Neophodan u održavanju citoarhitekture miofibrila
 Oštećenje distrofina
 destabilizacija stanične membrane
 intracelularno nakupljanje Ca2++
 Propadanje miofibrila
 Urastanje vezivnog tkiva
Distrofin
 N-terminalni kraj
 Štapićasti dio sa ponavljajućim sekvencama (24
jedinice)
 Cistein-bogat kraj
 C-terminalni kraj
Mišićne distrofije
 Mutacije gena za distrofin
 DMD
– distrofin se najčešće ne stvara ili
- u vrlo malim količinama
 BMD
– distrofin prisutan u manjoj količini
- veličinom prevelik
- smanjene molekularne mase
Greške u sintezi distrofina
DMD
BMD
DM
D
Analiza ekspresije distrofina
 Genetička analiza –spektar mutacija širok zbog
veličine gena koji kodira distrofin
 Imunološke metode za detekciju distrofina u
bioptičkom materijalu mišića
 Imunohistohemija (prisustvo/nedostatak distrofina,
lokalizacija, relativno jednostavna metoda)
 Western blot
Western blot
 Detektabilan distrofina prisutan i u manjoj količini
 različite molekularne mase proteina
 Istovremena detekcija više proteina za mišićnu
distrofiju
 veća senzitivnost
 tehnički zahtjevan
 Biopsija mišića (obično m. Gastroknemius)(od 20 - 80
mg)
Antitijela za distrofin
 više vrste antitjela za različite domene proteina
 Antitjela za COOH-domenu proteina ,
 Antitjela za NH2-domenu proteina
 Antitjela za štapićastu domenu
Ekspresija distrofina kod DMD
i BDM
 Pacijenti sa BMD –detekcija različitih izoformi distrofina
ili smanjena ekspresija moguća koriseći 3 antitijela
 Kod 26,6% pacijenata sa BMD smanjena ekspresija
distrofina
 Kod većine BMD pacijenata distrofin manje
molekularne mase
 Kod 73,3% pacijenata sa DMD potpuni nedostatak
ovog proteina
DMD
Tri različita AT za različite domene
distrofina. Potpuni nedostatak distrofina od
pacijenata sa DMD
M
C
1
A
2
3
4
A
5
C
1
2
B
3
4
5
B
A- AT za štapićastu domenu
B. AT za COOH kraj distrofina
C-kontrola
jažica 1-BMD, smanjena ekspresija distrofina;
jažica 2 - DMD;
Jažica 3– teški oblik BMD, ekspresija distrofina nedetektabilna
Jažica 4- BMD; različite izoforme distrofina;
Jažica 5 -DMD
Fig. 1. Immunoanalysis of muscle homogenates from five patients with DMD/D
A. Blot labeled with antibodies to rod domain of dystrophin (400kDa )M-Molecul
marker weight; C-normal control; lane 1-BMD, reduced dystrophin labelling; lan
DMD; lane 3-severe BMD, dystrophin immunolabeling almost undetectable ;lane
BMD, truncated dystrophin; lane 5-DMD B. Blot labeled with antibodies to carbo
terminus of dystrophin (400kDa) C-normal control; lane 1-BMD, reduced dystrop
labelling; lane 2-DMD; lane 3-severe BMD, absence of immunolabelling ;lane 4-B
truncated dystrophin; lane 5-DMD . Note that the complete loss of all bands in lan
StripA is evidence that the multitude bands seen in control l anes are dystrophin
metabolites and not product of other genes .
Hvala na pažnji