Transcript Fifth round table on apoptosis

Apoptoza u neuromuskularnim i
neurodegenerativnim bolestima
Goran Šimić
Đurđica Šešo-Šimić
5. Okrugli stol
Apoptoza - programirana smrt stanice
Akademija medicinskih znanosti Hrvatske
i Hrvatski institut za istraživanje mozga
13. ožujka 2013. Zagreb
Hrvatska zaklada za znanost
Projekt br. 09/16 (2012-2014)
Croatian Science Foundation
Vanjski put aktivacije apoptoze („Extrinsic" apoptosis pathway)
Withdrawal
of
Growth
Factors
Apo2
/
Apo3
PKC
RIP
TRAF2
Procaspase 8
Procaspase 8
PI3K
p90RS
K
BID
Caspase 8
BAD
IkBa
FLIP
IKKs
Akt1
NF-kB
CIAP1
Caspase3
SMAC
Caspase 7
Caspase 9
BAK
tBID
Arts
BCLXL
Apoptosis
APAF
1
HTRA2
MMP
BCL2
Noxa
Cytoc
Apoptosis
V
D
PMRA
C
CypD
Apoptosis
ICAD
CA
D
Depolarization
EndoG
AIF
Oncogenic
Signal
POD
p14(ARF)
EndoG
PML
PARP
CAD
Daxx
ATM
DNA Fragmentation
Apoptosis
NF-kB
Chk2
FLIP,CIAP2,BFL1,
BCL2
p53
p53
BAK,BAK,BID,
Ras,Noxa,PUMA,
APAF1,Survivin,
BCL2
MDM2
Unutarnji put aktivacije apoptoze („Intrinsic" pathway - /mitochondrial/ apoptosis)
Growth
Factors
Withdrawal
of Growth
Factors
Chemotherapeutic Drugs
Growth Factor
Receptor
PK
C
PI3K
p90RSK
Akt
BAD
BID
Caspase 8
BAK
CIAP1
Caspase 3
tBID
SMAC
BAX
BCLXL
Arts
Caspase9
APOPTOSIS
V
D
A
PMR
C
CypD
BCL2
BIM
MMP
HTRA2
p53AIP1
APAF1
Noxa
CytoC
PUMA
Depolarization
AIF
Endonuclease G
p14ARF
Oncogenic
Signal
Caspase12
ER Stress
EndoG
DNA
Fragmentation
AIF
MDM2
p53
Gene
Expression
DNA Damage
p53
Chk2
ATM
p53
Pojednostavljeni prikaz vanjskog i
unutarnjeg puta aktivacije apoptoze
PTP = promjene u
permeabilnosti
membrane
mitohondrija
(permeability
transition pore),
 = membranski
potencijal
mitohondrija,
ROS = slobodni
radikali kisika
(reactive oxygen
species)
Miller JB, Girgenrath M. The role of apoptosis in neuromuscular diseases and
prospects for anti-apoptosis therapy. Trends Mol. Med. 2006;12:279-286
ICC prikaz aktivirane kaspaze-3 u bioptatima mišića
u različitim kategorijama nasljednih NM bolesti
SMA1, SMA2
SMA3
DMD, BMD,
LGMD, FSHD
CMT1
Weller et al., Greenfield’s neuropathology, 2002
In situ detekcija oligonukleosomalnih
fragmenata DNA
- gel elektroforeza (nedovoljno informativna)
- in situ tehnike obilježavanja oligonukleosomalnih
fragmenata DNA:
- TUNEL (“terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick
end labeling”)
- ISEL (“in situ end-labeling”) – manje lažno pozitivnih rezultata
- Na 3’ kraju oligonukleosomalnih fragmenata DNA vežu se
obilježeni nukleotidi (kod ISEL metode biotinom, u TUNEL
metodi fluorescinom), koji se zatim vizualiziraju (kod ISEL
metode pomoću avidina konjugiranog peroksidazom, a
kod TUNEL metode antifluorescinskim protutijelom
konjugiranim peroksidazom)
Dokazivanje ultrastrukturalnih obilježja apoptoze
-
do sada su obilježja apoptoze
proučavana uglavnom na limfocitima i
neuronima, manje na mišićnim
stanicama
-
kondenzacija jezgre i citoplazme
fragmenacija DNA u
oligonukleosomalne fragmente putem
aktiviranih endonukleaza
kondenzacija kromatina sve do piknoze
jezgre
protruzije stanične membrane
(zvjezdolik izgled)
stvaranje “apoptotičkih tijela” i
odstranjivanje heterofagocitozom
-
-
Clarke P, Anat Embryol, 1990
Nasljedne spinalne mišićne atrofije (SMA)
- heterogena skupina bolesti koje
zahvaćaju DMN
- u djece najčešće zahvaćaju
proksimalne skupine mišića ruku
i nogu te interkostalne mišiće
- incidencija 4-10/100.000
- najčešći oblik se nasljeđuje AR
- uzrok SMA su delecije SMN1
gena (eksona 7) na dugom kraku
5. kromosoma
Količina funkcionalnog SMN proteina pune
duljine korelira s kliničkom slikom SMA
% količine SMN proteina pune duljine
razina SMN proteina potrebna za normalnu funkciju motoneurona (otprilike 23%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Normal
SMN1+/+
Carrier
SMN1+/-
SMA-3
SMN1-/4-8 SMN2
SMA-2
SMN1-/3-4 SMN2
SMA-1
SMN1-/2-3 SMN2
Feldkötter et al., Am J Hum Genet, 2002
Funkcije SMN proteina
- dio makromolekularnog kompleksa koji
sastavlja male ribonukleoproteine jezgre
- sam ima anti-apoptotičku aktivnost (Iwahashi et al.,
Nature, 1997)
- djeluje sinergistički s anti-apoptotičkim
članovima bcl-2 obitelji (Anderton et al., Neuroscience 2012)
- služi kao transporter molekula aktina koje
imaju važnu ulogu u diferencijaciji motoričkih
neuroblasta (izrastanju aksona i dendrita)
Klinička slika SMA
- hipotonija i progresivna mišićna slabost
proksimalnih mišića udova
- smanjena spontana mišićna aktivnost i ugasli
duboki tetivni refleksi (arefleksija)
- tip “0” – teški prenatalni oblik bolesti
- tip 1 - Werdnig-Hoffmannova bolest
- tip 2 – srednje teški oblik bolesti
- tip 3 – blagi oblik (Wohlfart-KugelbergWelanderova bolest)
- tip 4 – adultni oblik
SMA tip 1
-
oskudni pokreti fetusa
pri rođenju hipotonija, tihi plač
novorođenče ima poteškoće pri hranjenju
dijete nikad ne nauči sjediti samostalno
smrtni ishod prije druge godine života zbog
razvoja respiratorne insuficijencije
- mentalni razvoj normalan
SMA tip 1
teška hipotonija
glavica zaostaje u trakciji
Zbog slabosti interkostalne muskulature djeca sa SMA dišu
isključivo pomoću kontrakcija dijafragme. Stoga dolazi do
čestih i teških respiratornih infekcija, a smrt nastupa obično
unutar godine dana od postavljanja dijagnoze.
SMA tip 2
- dijete sjedi samostalno
- nikad ne prohoda samostalno
- tipičan tremor prstiju i šaka zbog fascikulacija i mišićne
slabosti
- očituje se od 3. mjeseca života
- smrtni ishod najčešće do kraja 7. godine života
SMA tip 3
- očituje se obično nakon 18. mjeseca života kada dijete
prohoda
- dijete hoda gegajući se, teško hoda po stubama, često
pada
EMG
- znakovi neurogenog
oštećenja: fibrilacija i
fascikulacije mišića
- brzina provođenja
normalna, u teškim
oblicima može biti
usporena (zbog retrogradne
normalan nalaz
SMA
Waalerove degeneracije uslijed
propadanja DMN i sekundarne
demijelinizacije)
- normalan nalaz ne
isključuje mogućnost
SMA (treba ponoviti
pretragu)
- potencijali imaju
velike amplitude, ali
nisku frekvenciju
miopatija
(DMD,
BMD)
Ilustracija preuzeta s
http://emedicine.medscape.
com/
Histopatologija SMA - mišić
neurogena atrofija mišića:
- karakteristična izmješanost fascikula
atrofičnih i hipertrofičnih vlakana
SMA tip 1, biopsija m. biceps brachii (H-E bojenje)
Semikvantitativno
ođređena pozitivnost
Izraženost aktivirane kaspaze 3 u skvrčenom pojedinačnom
mišićnom vlaknu koje umire apoptozom
Akt. kaspaza-3 (200x)
ISEL 440x
Pretpostavlja se da je uzrok apoptoze
mišićnih vlakana u SMA izostanak inervacije
(a to je posljedica gubitka motoneurona
leđne moždine)
Histopatologija SMA – leđna moždina
Bojanje krezil-violetom po Nisslu
- prednji rogovi leđne moždine: simetričan gubitak
alfa motoneurona (A = kontrola, B = SMA tip 1)
Tip 1 (apoptoza) –
rane promjene
Šimić G. et al., J. Neuropathol.
Exp. Neurol. 2000
TUNEL
Tip 1 (apoptoza) –
kasne promjene
ISEL
Šimić et al., J. Neuropathol.
Exp. Neurol. 2000
Nissl
Tip 1 / tip 2 (apoptoza/autofagija)
Šimić et al., J. Neuropathol.
Exp. Neurol. 2000
Tip 3b
(citoplazmatska smrt, nekroza)
Šimić G et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2000;
Šimić G, Acta Neuropathol., 2008
Zaključak
• Apoptoza ima značajnu ulogu u patogenezi
SMA, inicijalno zbog odumiranja motoneurona
(aktivacijom unutarnjeg puta), a zatim i zbog
degeneracije mišićnih vlakana vjerojatno
aktivacijom vanjskog puta
Mišićne distrofije
- genetički vrlo heterogena skupina
bolesti
- klinički vrlo slične
- dominira atrofija proksimalnih mišića
ramenog i zdjeličnog obruča te
pseudohipertrofija mišića potkoljenice
- tijek bolesti progresivan
- blag do potpun gubitak mišićnih funkcija
Nasljedne mišićne distrofije
- abnormalnosti distrofina i
proteina povezanih s
distrofinom uzrok većine
mišićnih distrofija
- distrofinopatije:
• MD Duchenne – distrofin
potpuno nedostaje
• MD Becker – količina
distrofina smanjena
- po učestalosti značajne i:
• pojasne mišićne distrofije –
LGMD
• facioskapulohumeralna FSHD
imunofluorescencija distrofina
normalan
mišić
DMD
BMD
Karpati et al., Disorders of Voluntary Muscle, 2010
Distrofinsko-glikoproteinski kompleks (os)
- distrofin s ostalim
citoskeletnim
proteinima omogućuje
mehaničku podršku
mišićnoj membrani i
normalnu kontraktilnost
mišićnog vlakna
Karpati et al., Disorders of Voluntary Muscle, 2010
Distrofinopatije
- mutacija gena za distrofin na
Xp21 kromosomu
• DMD: mutacija zahvaća
okvir čitanja gena i distrofin
se u većini vlakana ne
proizvodi
• BMD: delecija ne zahvaća
okvir čitanja, već pojedine
eksone; nastaje skraćeni
oblik distrofina, blaža
klinička slika
BMD
DMD
Karpati et al., Disorders of Voluntary Muscle, 2010
Klinička slika DMD
- prvenstveno boluju muška djeca, djevojčice
obolijevaju uslijed inaktivacije kromosoma X
(Turnerov sy, translokacija kromosoma X)
- učestalost - 1:3500 novorođenih dječaka
- najčešća klinička manifestacija u dobi 3-5 god.
- nestabilni hod na prstima, gegajući hod,
pozitivan Gowersov znak,
pseudohipertrofija potkoljenica (zbog
umnažanja veziva i masnog tkiva), lordoza,
izbočen trbuh, scapulae alatae, većina ima
snižen IQ
- kardiomiopatija često nezamjećena zbog
mirovanja
- nepokretnost između 7-12 god., smrt između
15-21 god. zbog respiratorne insuficijencije
- povišena vrijednost serumske CK 50-100 x već
u pretkliničkoj fazi bolesti
Klinička slika BMD
-
blaži oblik
manifestira se obično između 10-20 god.
bolesnici hodaju i 30 god. nakon prvih simptoma
količina distrofina u mišiću je 3-20% normalnih
vrijednosti
- često snižen IQ
- povišena vrijednost serumske CK (5 i više puta)
EMG
normalan nalaz
SMA
miopatija (DMD, BMD)
Potencijali niskih aplituda, fibrilacije, ali normalna brzina
provođenja
Ilustracija preuzeta s http://emedicine.medscape.com/
Histopatologija DMD i BMD
regenerirajuća
vlakna s
bazofiličnom
citoplazmom i
velikim
jezgrama
hiperkontrahirana
eozinofilična
vlakna
H-E 140x
DMD 2 god.
DMD 6 god.
DMD 11 god.
nadomještanje
mišićnog masnim
i vezivnim tkivom
- destrukcija mišićnih vlakana
- regenerativne promjene mišićnih vlakana
- imunohistokemijsko dokazivanje distofina u bioptatu mišića
neophodno za donošenje dijagnoze
• radi razlikovanja DMD od BMD kvantitativno određivanje
količine distrofina PCR-om
Izgled mišićnih vlakana u bolesnika s DMD
H-E, 75x
H-E, 60x
- opsežan gubitak mišićnog tkiva koje je gotovo u cijelosti zamijenjeno
masnim i vezivnim tkivom („pseudohipertrofija“) te varijabilna veličina
preostalih mišićnih vlakana; na pojedinim rezovima (crne strelice) bila su
jasno uočljiva područja invazije preostalih mišićnih vlakana od strane
makrofaga
Izgled mišićnih vlakana u bolesnika s BMD
promjene u
ranom i
umjerenom
stadiju
promjene
u kasnom
stadiju
- šarolika histološka slika: obilježja ranih, umjerenih i kasnih stadija
- rani: nakupine nekrotičnih mišićnih vlakana, invazija fagocita (siva strelica)
- umjereni: pokušaj regeneracije vlakana (crne strelice)
- kasni: povećena količina vezivnog tkiva (pseudohipertrofija), divovska vlakna (plave strelice)
hiperkontrahirana vlakna (zelena strelica)
Izraženost kaspaze-3 i ISEL pozitivnosti u
bioptatima mišića bolesnika s MD
BMD, ISEL, x60
BMD, imf na akt. kaspazu-3 + DAPI, x200
DMD, ISEL, x200
Zaključak – neuromišićne bolesti
• Broj mišićnih stanica pozitivnih na aktiviranu
kaspazu-3 daleko je manji u BMD i DMD (kod
LGMD i FSHD gotovo zanemariv) nego u SMA.
• Ipak, iako ne statistički značajan, uočen je trend
manjeg broja pozitivnih stanica u starijih
ispitanika, te veći broj apoptotičnih stanica u
DMD u odnosu na BMD
• Apoptoza u ovim mišićnim stanicama očigledno
nastupa aktivacijom unutarnjeg puta
Apoptoza u neurodegenerativnim
bolestima – Alzheimerova bolest
Hipokampalna
formacija
Nema izražene apoptoze živčanih
stanica u Alzheimerovoj
bolesti (Šimić G. et al., Exp.
Neurol. 2000)
Abortivna apoptoza (abortoza)
Budući da su u AD
aktivirane neke
aktivacijske kaspaze,
npr. kaspaza 8 (slika A)
i kaspaza 9 (slika C) u
CA1 području
hipokampusa (Raina et
al., 2001), ali nisu
izvršne (npr. kaspaze 7,
6 i 3), ovaj proces je
nazvan abortivna
apoptoza (abortoza).
Reina et al., 2001
Tip 4 (aponekroza, abortoza)
Cheng et al.,
Biochem. J.
2003
Stanična smrt – kontinuum promjena
Martin, Prog. Mol. Biol. 2012
ALS (Lou „Buster” Gehrig’s disease)
Ledler & Dokholyan, Prog. Mol. Biol. 2012
Mutacije gena povezanih s nastankom
fALS
Ledler & Dokholyan, Prog. Mol. Biol. 2012
Mutacije Cu,Zn-SOD1 gena
Ledler & Dokholyan, Prog. Mol. Biol. 2012
Ledler & Dokholyan, Prog. Mol. Biol. 2012
Aktivacija apoptoze u ALS vanjskim putem
Zbog mutacije SOD1, disfunkcionalni protein se veže za VEGF mRNA, zbog čega nastupa
gubitak neurotropne potpore aksonima motoneurona (nastupa povlačenje aksona s NMJ).
Ledler & Dokholyan, Prog. Mol. Biol. 2012
Aktivacija apoptoze u ALS unutarnjim putem
Martin, J. Bioenerg. Biomembr. 2011
Ledler & Dokholyan, Prog. Mol. Biol. 2012
ALS / FTLD-U kontinuum – aktivacija
unutarnjeg puta
2006: transactive response DNA
binding protein (TDP-43) i
FUS/TLS (fused in sarcoma or
translocated in lyposarcoma)
Arai T et al., TDP-43 is a
component of ubiquitin-positive taunegative inclusions in FTLD and ALS.
Biochem Biophys Res Commun 2006,
351:602-611
Neumann M et al., Ubiquitinated TDP-43 in
FTLD and ALS. Science 2006,
314:130-133
Sreedharan J et al., TDP-43
mutations in fALS and sALS, Science 2008,
319:1668-1672
Kwiatkowski TJ Jr et al., Mutations in the
FUS/TLS gene on chromosome 16 cause
fALS. Science 2009, 323:1205-1208
FTLD / ALS – različiti fenotipovi uslijed
istih ili sličnih mutacija
Boxer et al., Alzheimer’s & Dementia, 2012
Zaključak – neurodegenerativne bolesti
Aktivacija apoptoze i vanjskim (ALS) i unutarnjim putem
ima značajnu ulogu i u brojnim drugim
neurodegenerativnim bolestima, posebice u ALS,
Huntingtonovoj bolesti, Friedreichovoj ataksiji i
sinukleinopatijama.
Iako dolazi do aktivacije pojedinih kaspaza i drugih
markera karakterističnih za rane faze apoptoze, apoptoza
nije dominantan način smrti živčanih stanica u tijeku
Alzheimerove bolesti (nema aktivacije aktivirane kaspaze3 (osim ponekad samo u CA1 području hipokampusa) kao
ni ultrastrukturalne morfološke potvrde da doista dolazi i
do izvršenja apoptoze).
Hvala na pažnji!
Prezentaciju možete preuzeti na:
http://alzbiotrack.hiim.hr
Hrvatska zaklada za znanost
Projekt br. 09/16 (2012-2014)
Croatian Science Foundation