Transcript Tema 1. Revisión bibliográfica, bases de datos, generación

Tema 5
Protocolos para obtención de
datos, calibrados, uso de hojas
de cálculo
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Etapas de una investigación
Análisis : tests estadísticos,
ajuste de curvas , ….
Exploración de datos
Obtención datos, calibrados, etc.
Diseño del experimento
Antecedentes Bibliográficos
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Diferentes protocolos para diferentes estudios (1/2)
1) Estudios experimentales (por ej. : Determinar la Km y
Vmax de una enzima usando regresión no lineal):
a) Concretar el procedimiento experimental.
b) Preparación de disoluciones y comprobar su estabilidad en el almacenamiento.
VITAL
c) Rectas de calibrado:
- Diferencia entre precisión y exactitud. Estimación de una media
con intervalo de confianza (barras de error)
- Ajuste de una recta a los datos por regresión lineal, bandas de
confianza.
- Predicción inversa.
d) Hacer las medidas experimentales del estudio, recopilar los datos en una tabla
de EXCEL y hacer una representación inicial de los datos.
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Diferentes protocolos para diferentes estudios (2/2)
2) Estudio observacionales (por ej. comparación de la
eficacia de un nuevo fármaco en pacientes tratados con
dicho fármaco frente a placebo (test t de student)):
a) Elegir la población objeto del estudio.
b) Establecer el tamaño de muestra, el tipo de aleatorización,
tipo de “ciego”.
c) Elaboración de encuestas o de procedimientos de medida.
d) Hacer las observaciones o medidas.
e) Recopilar los datos en una tabla de EXCEL.
(En lo que sigue (en este tema) nos ocuparemos
principalmente de lo estudios experimentales)
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
a) Establecer primero el protocolo experimental
Procedimiento
Termostatar
1) 0.1 mL enzima
2) 0.1 mL sustrato
3) 9.6 mL disolvente
4) 0.2 mL agua
10 mL total
Toma de
muestra
1) Tiempos ( 1h, 2h, 3h,…24h)
2) 200 mL muestra + 400mL tampón
Medida de
absorbancia
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Se suelen hacer réplicas de muestreo
Enzima
+
Sustrato
Réplicas de muestreo (3 réplicas a cada sustrato) ¡CV(%) grande!
Se toman
alícuotas
Medida Absorbancia
No suele ser necesario réplicas de técnica
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
¡CV(%) pequeño!
¿Cuántas réplicas se deben hacer?
1) Cuando se desea estimar la media:
CV(%)
X
n º de réplicas  3
1 2 3 4 5 nº réplicas
(La media se estabiliza a partir de 3)
2) Cuando se desea estimar la desviación estándar:
s
n º de réplicas  5
CV(%)
1 2 3 4 5 nº réplicas
(La desviación estándar se
estabiliza a partir de 5)
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
b) Preparación disoluciones en base al protocolo experimental
A preparar:
[E] = 100 mg /mL
[S] = 200 mg /mL
Procedimiento:
1) 0.1 mL enzima
Se desea en reactor:
2) 0.1 mL sustrato
[E] = 1 mg /mL
3) 9.6 mL disolvente
[S] = 2 mg /mL
4) 0.2 mL agua
10 mL total
Hacia atrás
0.9 mg/mL
1) Tiempos ( 1h, 2h, 3h,…24h)
2) 200 ml + 400ml tampón
[S] = 0.3 mg/mL
Hacia adelante
(Multiplicar por 3)
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Obtener datos sin artefactos
• Buenas prácticas experimentales:
 Hacer bien referencias en la técnica analítica
 Analizar bien controles o blancos.
Comprobar exactitud y línea base de aparatos
• Buenas prácticas numéricas:
 Para cálculos elegir unidades para que los valores sean del
orden de “ 1 ” (ej. 3.2 mM es mejor que 0.0000032 M o 3.2.10-6 M)
Trabajar con los valores de todas las réplicas (no sus medias),
para que los tests estadísticos en el ajuste de curvas tengan los
grados de libertad correctos.
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Recordatorio de cifras significativas
Concepto de cifra significativa :
Dado un número, se entiende por cifra significativa cualquier dígito no nulo (1 al 9), cualquier
cero situado entre dígitos no nulos y cualquier cero situado a la derecha del número.
Ejemplos:
0.0000689 = 6.89 · 10-5  3 cifras significativas
 3 cifras significativas
2.080 · 10-3  4 cifras significativas
0.00208
= 2.08 · 10-3
0.002080
=
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Recordatorio de reglas para los cálculos
1) Al registrar el valor numérico de una magnitud, se escriben sólo las cifras significativas
adecuadas (se supone que la incertidumbre en la medida es de 
1 en la última cifra
significativa dada). Ej: con un termómetro de décimas se anotaría 25.2 ºC (no 25 ni 25.20).
2) Si se quiere redondear un número que tiene cifras significativas superfluas, auméntese en
una unidad la última cifra retenida si la primera cifra desechada es 5 o mayor.
3) Cuando se suman o se restan números, el resultado se da con tantas cifras decimales como
tenga el número con menor número de decimales.
Ejemplo:
0.12 + 12.2324 + 1.568
= 13.9204 (mal)
= 13.92 (bien)
4) Al multiplicar y dividir números, el resultado se da con las cifras significativas necesarias
para que su incertidumbre sea semejante a la incertidumbre relativa del factor que menos
cifras significativas tenga. En la práctica viene a ser equivalente a expresar el resultado con el
mismo numero de cifras significativas que las que tenga el factor con menos cifras
significativas. (Obsérvese que este criterio se refiere a las cifras significativas, no a los decimales de los
números).
Ejemplo: imaginemos el siguiente cálculo
157.8 
1.82 = ¿ 3.54562963 ? (¿Por dónde cortar?)
81
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
3.5
Diferencia entre precisión y exactitud.
Precisión
Hace referencia a la repetitibilidad de una medida. Así, se dice que unas medidas
repetidas son precisas cuando presentan pequeñas diferencias entre si y son
reproducibles. La precisión de unas medidas repetidas se cuantifica con los
procedimientos de la Estadística Descriptiva, principalmente con la llamada
desviación estándar de la muestra.
Exactitud
Hace referencia a la concordancia de la medida con el valor verdadero o exacto. Se
dice que una medida es tanto más exacta cuanto más se acerca a su valor
verdadero. La exactitud de una medida se cuantifica en base a “patrones” y “curvas
de calibrado”.
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Simil para diferencia entre precisión y exactitud.
Imaginemos el tiro con carabina a una diana:
Error absoluto y error relativo
Error absoluto:
Error relativo:
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Estimación de una media por intervalo de confianza
Población: niños españoles al nacer
Variable: Peso en kg
μ ???
3.5
Muestra grande
3.7
2.8
3.3
…..
μ ( IC al 95% de confianza)
x  3.4  ???
Intervalo de confianza
Límites de confianza
Población: células en un cultivo Muestra pequeña 6.2 106
Variable: nº células/mL
6.8 106
5.9 106
Réplicas
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
x  6.310
6
 ???
Recordatorio de la distribución normal
Basado en J.P. Domènech (Bioestadística)
Normal:
 1  
f ( x)  
e

2



 x m 
Normal estandarizada:
2
2 2
va l oresesta nda riz
a dos:
(x  m)
zi  i

 1
f ( z)  
 2

e


z2
2
por tantocualquiervalorobtenidopara un individuocaerá 95% de las veces en : μ  2
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Comportamiento de las medias de diferentes muestras
sacadas de una población (Teorema del límite central)
Adaptado de J.P. Domènech (Bioestadística)
Se toman infinitas muestras
al azar de tamaño “n”
Población origen (x)
Población medias
x 
La va ri a bl ex si gue :
Las mediasx siguen :
medi a  m
Di st. norma l: 
2
va ri a nza 
media  m

Dist. normal: varianza  2 n

err .est .media  
por tantocualquiermediamuestralcaerá 95%veces en : μ  2( 
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
n)
n
Puntualizaciones acerca de la
varianza y desviación estándar
En la población
Varianza poblacional :  2 
2
(
x

m
)
 i
n
Desviaciónestándar poblacional :    2 
( x
i
 m )2
n
En un muestra (se hace la corrección de Bessel y en vez de n se pone n-1)

x  x


2
Varianza muestral(o cuasivarianza) : s
2
i
n 1
 x  x 
2
Desviación estándarm uestral(o cuasi desviación estándar): s  s 
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
i
n 1
Generalización para la estimación de una media por intervalo
vim osque la m ediade cualquierm uestracaía el 95% veces en intervalo μ  2
En general la estima de m de la
población desde una muestra Donde:
grande:
x  z
z
s
n
La estima de m de población
desde una muestra pequeña:
x  t( , )

n
, luego :
desvío para riesgo ,
normalmente:
0.05 10.95 95% 
z   1.96  2
Donde:
t( , )
s
n
“t” Student con n grados
de libertad y riesgo 
n n1
0.05 10.95 95% 
2 colas
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Ejemplo: estimación de medias con intervalos al 95%
Muestra 3
Muestra 1
5%
Muestra 2
Muestra 83
Muestra 3
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Ejemplo: simulación de medias con intervalos al 95%
Simulamos al azar: 7 muestras de
10 datos:
m  10   0.5
t( 9 , 0.05 )
Muestra 5
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 4
Muestra 3
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
s
n
 2.26
x  t(  , )
Muestra 6
Muestra 7
Otros tipos de límites de confianza (barras de error)
3 datos
LC 95%
3 datos
barras 1s
xs
7 datos
LC 95%
xt
s
xt
n
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
s
n
7 datos 30 datos 30 datos
barras 1s LC 95% barras 1s
xs
xt
s
n
xs
Cálculo de límites de confianza (SIMFIT)
Statistics > Statistical calculations > Estimate parameter confidence limits
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Cálculo de límites de confianza (SIMFIT)
Ejemplo:
Número de sujetos: n = 20
Media en la muestra:
x  15
Desviación estandar muestra:
s4
% de confianza: 95
13.1-------15.0------16.9
O también: 15.0
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

1.9
c) Rectas de calibrado y predicción inversa
Ajuste de una recta por regresión lineal simple y bandas de confianza
El llamado método de Allen se utiliza para medir concentraciones de fosfato en base a una reacción
coloreada con molibdato. Para ello hay que hacer primero la recta de calibrado o ley de Beer a partir
de unos patrones de fosfato.
Predicción inversa
Evaluación
SIMFIT
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
c) Rectas de calibrado y predicción inversa.
Evaluación y predicción inversa
Evaluación: Se introduce la “x” y se desea la “y” (no suele tener interés)
Predicción inversa: Se introduce la “y” y se desea la “x” (es lo que
interesa, medir la absorbancia de una muestra y estimar la [fosfato])
0.231
0.472
SIMFIT
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
d) Hacer las medidas experimentales del estudio de que se
trate, recopilar los datos en una tabla de EXCEL y hacer una
representación inicial de los datos.
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Manejar bien hoja de cálculo Excel
Excel 2007
1) Combinar celdas: Inicio > Combinar y centrar > Ajustar texto
2) Insertar gráficos, por ejemplo línea recta ajustada por regresión lineal
Seleccionar celdas > Insertar > Dispersión > primer estilo > se despliega una
barra herramientas > Deplegar tipos con
y seleccionar cuadro con f(x)
(aparece la recta de ajuste y su R2).
3) Introducir una fórmula sencilla, por ejemplo: (celda1 + celda 2)*7/100
=(A1+B1)*7/100
4) Opción autocompletar : se propagan los cálculos de una fórmula
si uno arrastra la celda con la fórmula estirando con el cursor en la
esquina derecha.
5) Utilización de funciones: por ej. función SI……
Fórmulas > Insertar función > SI (Prueba_lógica; valor_si_verdadero;
valor_si_falso)
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Existen muchas funciones en Excel
Excel 2007
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Otras herramientas de Excel
1) Ordenar y filtrar:
Ordenar:
Ordenar de menor a mayor, ordenar de mayor a menor,
ordenar de A a Z, ordendar de Z a A.
Filtrar:
Ej: Seleccionar la columna deseada > ordenar y filtrar > filtrar
> Se despliega arriba en la columna una flecha > filtros de
número > inferior al promedio
2) Tablas dinámicas para resumir datos:
Insertar > tabla dinámica
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Aspectos avanzados de la hoja de
cálculo Excel: uso de macros
Abble bits (Merge Tables wizard)
SIMFIT6.XLS
Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado