Transcript B. Leininger enzymologie générale

ENZYMOLOGIE GENERALE
PACES 2010-2011
Professeur Brigitte LEININGER-MULLER
Faculté de Pharmacie
Faculté de Médecine
5, rue A. Lebrun
INSERM U954
54000 NANCY
Bâtiment C, 2ème étage
INTRODUCTION
1. NOTIONS GÉNÉRALES
1.1. Catalyse enzymatique
1.2. Définitions
1.3. Localisation et variations physiopathologiques
1.4. Isoenzymes
1.5. Proenzymes ou zymogènes
1.6. Enzymes inductibles
2. STRUCTURE ET SPÉCIFICITÉ DES ENZYMES
2.1. Apoenzyme et coenzyme
2.2. Nécessités auxquelles doit répondre la structure des enzymes
2.3. Site actif
2.3.1. Définition – nature - fonctionnement
2.3.2. Conformation du site actif
2.4. Spécificité des réactions enzymatiques
3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE
3.1. Notions de cinétique des réactions
3.1.1. Vitesse de réaction – Vitesse instantanée
3.1.2. Différentes phases de la réaction enzymatique
3.2. Principe de la mesure des vitesses des réactions
enzymatiques – Unités
3.3. Cinétique michaelienne
3.3.1. Variation de la vitesse en fonction du temps
3.3.2. Variation de la vitesse en fonction de la quantité
d’enzyme
3.3.3. Effet de la concentration de substrat - Vitesse initiale
3.3.4. Equation de Michaelis et Menten - Hyperbole de
Michaelis-Menten
3.3.5. Détermination de Km
- Représentation de Lineweaver et Burk
- Représentation de Eadie - Hofstee
3.4. Effecteurs chimiques de la réaction enzymatique
3.4.1. Activateurs
3.4.2. Inhibiteurs
3.4.2.1. Inhibiteurs compétitifs
3.4.2.2. Inhibiteurs non compétitifs
3.4.2.3. Inhibiteurs incompétitifs
3.4.3. Effecteurs allostériques
4. CLASSIFICATION DES ENZYMES. INTÉRÊT EN BIOLOGIE
4.1. Nomenclature
4.2. Oxydo-réductases
4.3. Transférases
4.4. Hydrolases
4.5. Lyases
4.6. Isomérases
4.7. Ligases
Un catalyseur
agit à des concentrations très faibles en comparaison avec les
quantités des composés en réaction
spécifique d’une réaction donnée, c’est à dire qu’il n’active
que cette réaction
se retrouve à la fin de la réaction tel qu’il était avant la réaction
composé qui n’accélère que les réactions thermodynamiquement
possibles, i.e :
celles qui se traduisent par une diminution d’enthalpie libre.
Le catalyseur diminue l’énergie d’activation nécessaire à la réaction.
VARIATION D’ENERGIE AU COURS D’UNE REACTION
AVEC ET SANS CATALYSE
Niveau d’énergie E
S…P
- enzyme
Sans catalyse
SEP
+ enzyme
S..E..P
Avec catalyse
S+P
E2 <<< E1
Etat initial
SP
Etat final
temps
DEFINITIONS
ENZYME : Protéine présentant des propriétés de catalyse spécifiques d’une
réaction chimique du métabolisme de l’être vivant qui la produit
SUBSTRAT : Molécule qui entre dans une réaction pour y être transformée grâce à
l’action catalytique d’une enzyme
PRODUIT : Molécule qui apparaît au cours d’une réaction catalysée par une enzyme
LIGAND : Corps chimique ayant une liaison spécifique avec une protéine
COFACTEUR : Corps chimique intervenant obligatoirement dans une réaction
enzymatique
- pour transporter ou compléter un substrat
- pour accepter un produit
- comme participant à la structure de l’enzyme
COENZYME : Molécule biologique intervenant comme cofacteur indispensable
dans la catalyse enzymatique d’une réaction
Les coenzymes libres interviennent de manière stoechiométrique
Les coenzymes liés interviennent dans la réaction de manière catalytique
Le site actif d’une enzyme comporte 2 sites voisins :
- le site de fixation du S. (ou site de reconnaissance)
- le site responsable de la réaction chimique catalysée :
= site catalytique
SCHEMA DU SITE ACTIF DE LA CHOLINESTERASE
MODELISATION DE LA REACTION ENZYME / SUBSTRAT : 2 hypothèses
Serrure / clé : Modèle de Fisher
Site actif
Ajustement induit : Modèle de Koshland
SCHEMA GENERAL D’UNE REACTION ENZYMATIQUE
Enzyme
Substrat
+
Produit
Energie
Coenzymes
Ions
-
EVOLUTION DES CONCENTRATIONS DE S (substrat) ET DE P (produit)
au cours de la REACTION ENZYMATIQUE, en fonction du TEMPS
[S] ou [P]
V=
=
temps
DIFERENTES PHASES DE LA REACTION ENZYMATIQUE
[Produit]
temps
[ES]
[S] >>>[P]
[EP]
UNITES UTILISEES EN ENZYMOLOGIE
Unité internationale (UI) : quantité d'enzyme qui
transforme une micromole de substrat en 1 minute.
Katal (unité du système international) (kat) : quantité
d'enzyme qui transforme une mole de substrat en 1
seconde.
Ceci correspond à des quantités énormes d'enzyme
→ utilisation de sous-multiples : µkat ou nkat
1 UI = 16,66 nkat
EFFET DE LA QUANTITE D’ENZYME
E3
[P3]
[P2]
[P1]
E2
E1
EFFET DE LA CONCENTRATION EN SUBSTRAT
S10
[P]
S4
mmol/l
S2
[P10]
S1
[P4]
[P2]
[S10] >> [S4] >> [S2] >> [S1]
[P1]
t
temps
Vitesses initiales en fonction des concentrations en substrat :
Hyperbole
Vi
mmol/min
Constante de Michaelis :
[S]
mmol/l
CINETIQUE MICHAELIENNE
k1
E+S
k3
ES
k2
E = [enzyme]
S = [substrat]
P = [produit]
E+P
(1)
k4
ES = [complexe enzyme-substrat]
EP = [complexe enzyme-produit]
ET = [enzyme totale] = [E] + [ES]
Début de la réaction :
[P] ≈ 0 ⇒ [EP] <<<< [ES]
et
k1
E+S
réaction ES
k3
ES
k2
ES
k2
négligeable
E+P
k4
k1
E+S
E+P
k3
E+P
(1‘)
CINETIQUE MICHAELIENNE
Pendant la phase stationnaire (état d’équilibre) :
V = k3 [ES]
(2)
Vitesse de FORMATION de ES
[ES] = k1 [E][S]
(3)
Vitesse de DISPARITION de ES
[ES] = k2 [ES] + k3 [ES]
(4)
donc
k1 [E] [S]
Par réarrangement, on obtient
= (k2 + k3) [ES]
[ES] =
[E][S]
k2 + k 3
(6)
k1
On définit :
CONSTANTE
DE MICHAELIS
(5)
Km
k2 + k3
=
k1
(7)
En remplaçant k2+k3/k1 par sa valeur dans l’équation (6), on obtient :
[E][S]
[ES] =
Km
(8)
CINETIQUE MICHAELIENNE
[S] ≈ [S] totale, si [E] <<< [S] et
[ES]
=
[E] = [ET] – [ES]
([ET] – [ES])[S]
(9)
(10)
Km
Par réarrangement de cette équation, on obtient :
[ES]
[S]
= [ET]
[S] + Km
En remplaçant ES par cette valeur dans l’équation (2), V = k3 [ES]
(11)
on obtient :
[S]
V = k3 [ET]
[S] + Km
(12)
La vitesse maximale Vm est atteinte lorsque tous les sites enzymatiques sont
saturés en substrat, c'est-à-dire lorsque [S] >>> Km et donc
[S]
[S] + Km
Il s’ensuit que
tend vers 1
Vm = k3 [ET]
(13)
En remplaçant Vm par sa valeur dans l’équation (12), on obtient l’EQUATION DE
MICHAELIS-MENTEN
EQUATION DE MICHAELIS-MENTEN
V = Vm
[S]
------------[S] + Km
Cette équation décrit une courbe hyperbolique
Pour des concentrations faibles en substrat, lorsque [S] <<< Km
V = [S]
Vm
Km
La vitesse est alors DIRECTEMENT PROPORTIONNELLE à la concentration en substrat
Pour des concentrations élevées en substrat, lorsque [S] >>> Km,
V = Vmax.
La vitesse est alors INDEPENDANTE de la concentration en substrat
VITESSE DE LA REACTION en fonction de la CONCENTRATION EN SUBSTRAT
(cinétique michaelienne)
DETERMINATION DE Km
• Méthode de Lineweaver-Burk
L’inverse de l’équation de Michaelis-Menten conduit à la formule suivante :
1
V
=
Km + [S]
Vm [S]
On peut écrire cette équation sous la forme :
1
V
=
Km
Vm [S]
[S]
+
Vm [S]
Cette équation peut se simplifier et s’écrire
1
V
=
Km
Vm
1
X
[S]
+
On voit que si Km = [S]
1
qui correspond à l’équation d’une droite
Vm
V = Vm X
1
1+1
Soit V =
Vm
2
y = ax + b
DETERMINATION DE Km
• Méthode de Lineweaver-Burk
L’équation
1
V
=
Km
Vm
X
1
[S]
+
1
Vm
peut s’illustrer de la façon suivante :
DETERMINATION DE Km
• Méthode de Eadie-Hofstee
V ([S] + Km) = Vm [S] soit V[S] + VKm = Vm [S]
V[S]
[S]
VKm
+
[S]
VKm
=
Vm
⇒
V = Vm -
[S]
V
= Vm - Km
[S]
INHIBITION IRREVERSIBLE : EXEMPLE DE L’ASPIRINE
Aspirine
inhibition irréversible des COX en
acétylant une sérine du SA
INHIBITION COMPETITIVE
compétition entre le substrat et l'inhibiteur pour se lier à l'enzyme.
k
ki
INHIBITION COMPETITIVE : EQUATIONS
INHIBITION COMPETITIVE : REPRESENTATION CINETIQUE
[I]1
[I]2
[I]2 = 2 [I]1
[I]1
[I]2
Vm ne varie pas
INHIBITION COMPETITIVE : EQUATIONS INVERSES
INHIBITION COMPETITIVE : REPRESENTATION SELON LINEWEAVER-BURK
[I]2
[I]1
[I]0
[I]1
[I]2
CO
N
CO
Hypoxanthine
HN
CH
HN
CH
HC
N
HC
N
NH
N
NH
Allopurinol
CO
N
HN
CH
OC
NH
CO
Xanthine oxydase
NH
NH
HN
CO
OC
NH
Xanthine
NH
Acide urique
INHIBITION COMPETITIVE :
Exemple de l’inhibition de la
xanthine oxydase par
l’ALLOPURINOL, utilisé dans le
traitement de la GOUTTE
Autre exemple :
Ethanol et intoxication par « l’alcool à brûler »
= composé ménager : éthanol + méthanol (5%)
Méthanol : forte toxicité :
métabolisé par l’alcool deshydrogénase en formaldéhyde,
très toxique pour les tissus (cristallin
risque de cécité) :
CH3-OH
HCHO
Perfusion d’une solution diluée d’éthanol
inhibiteur compétitif
de plus, l’alcool deshydrogénase oxyde l’éthanol en acétaldéhyde :
CH3-CH2-OH
CH3-CHO
INHIBITION NON COMPETITIVE
Liaison sur ES
Liaison sur l'enzyme libre
INHIBITION NON COMPETITIVE : EQUATIONS
INHIBITION NON COMPETITIVE
Equation de Michaelis-Menten
Représentation cinétique
[I]0
[I]2 =
[I]1
[I]1
[I]2
[I]2
2 [I]1
INHIBITION NON COMPETITIVE
Equation inverse
Représentation selon Lineweaver-Burk
[I]
2
[I]
2
[I]
1
[I]
[I]
1
0
INHIBITION NON COMPETITIVE : Exemple de l’inhibition de l’ANHYDRASE
CARBONIQUE par l’ACETAZOLAMIDE, utilisé comme diurétique
Anhydrase carbonique
Gaz carbonique
Carbonate acide
Acétazolamide
INHIBITION INCOMPETITIVE : EQUATIONS
E+S
ES
E+P
ESI
[ES] [I]
Ki = ----------
[Et] = [E] + [ES] + [EI]
[ESI]
Vm [S]
[I]
1+
V=
Ki
[I]
[S]+ Km (1 +
Ki
)
INHIBITION INCOMPETITIVE : REPRESENTATION CINETIQUE
[I] 2 = 2[I]1
[I] 0
[I] 1
[I] 2
[I] 1
[I] 2
[I] 2 [I] 1
[I] 0
INHIBITION INCOMPETITIVE
ENZYMES ALLOSTERIQUES : MODELISATION
Modèle concerté : Monod
+S
T
T
+S
SS
R
R
S
S
R
R
S
SS
R
R
S
S
Modèle séquentiel : Koshland
T
T
+S
S
R
T
+S
CINETIQUE D’UNE ENZYME ALLOSTERIQUE
V
m
V
m
2
(cinétique michaélienne)
NOMENCLATURE DES ENZYMES
EC. 2 . 7 . 3 .
Enzyme commission
Classe :
Transférases
Sous-Classe :
Phosphotransférases :
Transférases qui transfèrent
un groupement contenant du
Phosphore
Sous-sous-classe :
Phosphotransférases qui
possèdent un groupement
Azote comme accepteur
Numéro d'ordre
dans la sous-sous-classe
2
CLASSES D'ENZYMES
1. Oxydoréductases : transfert d’électrons
2. Transférases : transfert de groupements de différentes natures
3. Hydrolases : réactions d’hydrolyse (transfert de groupements
fonctionnels sur l’eau)
4. Lyases : addition de groupements à des atomes engagés dans des
doubles liaisons ou formation de doubles liaisons par élimination de
groupements
5. Isomérases : échanges (de position, de groupement ou de fonction)
entre différentes molécules pour conduire à des isomères
6. Ligases : condensation de deux molécules
OXYDO-REDUCTASES
Exemple de la 3phosphoglycéraldéhyde
déshydrogénase
Réaction catalysée (in vivo)
Exemple de la
lactate
déshydrogénase
L-Lactate + NAD+
Pyruvate + NADH-H+
Réaction utilisée pour mesure d'activité (in vitro)
Pyruvate + NADH-H+
Lactate + NAD+
LES TRANSFERASES : AMINO- et PHOSPHO-TRANSFERASES (kinases)
EXEMPLE DE FONCTIONNEMENT D’UNE ENZYME
A PHOSPHATE DE PYRIDOXAL
réactions d'échange d'un groupement aminé –NH2 contre un groupement
cétone –CO entre un acide aminé et un acide α cétonique.
Alanine aminotransférase (ALAT)
Transaminase glutamique pyruvique (TGP)
NH3+
NH3+
alanine
ac. aminé
2-oxoglutarate
ac. α cétonique
pyruvate
glutamate
LES TRANSFERASES : ACETYL- et
ACYL-TRANSFERASES
LES TRANSFERASES : CARBOXYLASES
LES TRANSFERASES : METHYL- et MEYHYLENE et
METHENYL-TRANSFERASES
HYDROLASES
C – Z + H2O
C – OH + Z – H
H OH
H
OH
+
α-amylase (Hydrolyses de liaisons internes α-1, 4 de l’amidon)
ou
1,4-α-D-glucanne glucanohydrolase
LYASES
Fumarate
hydratase
ISOMERASES
Triose phosphate
isomérase
LIGASES ou SYHTHETASES
Utilisent directement l’énergie de l’ATP pour condenser 2 composés
Glutamine synthétase
O
–
acide glutamique
H2N – C – CH2 – CH2 – CH
+ NH2
COOH
NH2
–
–
OH – C – CH2 – CH2 – CH
–
=
NH2
=
O
ATP
+ H2O
COOH
glutamine