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UE Biochimie métabolique et enzymologie
TRAVAUX DIRIGES
ECUE 1 : Biochimie métabolique
Exercice 1
Combien d’équivalent d’ATP sont produits pour une oxydation complète en CO2 et en H2O
du glycéraldéhyde phosphate ?
Réponse : 19 ou 20 ATP selon la navette.
Exercice 2
Calculer le nombre d’ATP produits lors de la formation d’une mole de D-glucose à partir de
l’α-cétoglutarate dans le foie de rat.
Réponse : 8 ATP
Exercice 3
Quel est le bilan énergétique exprimé sous forme d’ATP si l’acétylCoA incorporé dans une
plante, se transforme en glycéraldéhyde phosphate.
Exercice 4
Calculez le nombre d’ATP produits lors du catabolisme aérobie et anaérobie du
glycéraldéhyde phosphate si le NADH2 utilise les navettes du glycérol phosphate ou du
malate.
Exercice 5
Combien d’ATP sont produits lors du catabolisme des composés suivants en CO2 et H2O ?
a) CH3 – (CH2)12 – COOH
b) CH3 – (CH2)3 – CH – CH2 – CH = CH – COOH
OH
O
c) CH2 – O – C – (CH2)4 – CH3
O
CH – O – C – (CH2)4 – CH3
O
CH2 – O – C – (CH2)4 – CH3
CH3
CH3
O
d) CH2 – O – C – CH2 – CH – (CH2)3 – CH – (CH2)4 – CH3
O
CH – O – C – (CH2)7 – CH = CH – CH2 – CH – CH2 – CH3
CH2 – OH
CH3
Exercice 6
Combien d’ATP sont produits lors de la synthèse aérobie de l’acide oléique si la seule
source de carbone est le glucose ?
Acide oléique: CH3 – (CH2)7 – CH = CH – (CH2)7 – COOH
Exercice 7
Si l’acide n-nanoïque, acide saturé en C9, marqué par du carbone 14 (14C) sur son carbone
7, est oxydé dans des conditions ou le cycle de Krebs fonctionne normalement, quels
atomes de carbones seront marqués dans les intermédiaires suivants :
a) Succinate
b) Oxaloacétate
c) α-cétoglutarate
Exercice 8
Lors de la biosynthèse de l’acide gras en C8, on utilise du malonylCoA marqué au carbone
14 (14C). Sur quels carbones de l’acide gras synthétisé retrouvera-t-on la radioactivité selon
que la malonylCoA est marqué :
a) Sur le – COOH
(HOO14C – CH2 – CO – SCoA)
b) Sur le – CH2
(HOOC – 14CH2 – CO – SCoA)
c) Sur le – CO –
(HOOC – CH2 – 14CO – SCoA)
ECUE 2 : Enzymologie
Exercice 1
a) Lorsqu’une réaction est d’ordre 0, comment varie la vitesse V en fonction de la
concentration en substrat S ?
b) Lorsqu’une réaction est d’ordre 0, comment varie la concentration en substrat S en
fonction du temps t ?
c) Lorsqu’une réaction est d’ordre 1, comment varie la vitesse V en fonction de la
concentration en substrat S ?
c) Lorsqu’une réaction est d’ordre 1, comment varie la concentration en substrat S en
fonction du temps t.
e) Donner la loi de la vitesse pour une réaction catalysée par une enzyme de type
Michaelien.
f) Que représentent KM et Vmax ?
g) Pour une réaction enzymatique Michaelienne, quelles sont les valeurs extrêmes de
l’ordre de la réaction suivant les concentrations de substrat S ?
Exercice 2
L’enzyme E présente pour un substrat S les constantes suivantes : KM = 10-4 M ; kcat = 10
sec-1. Pour [E] = 10-7 M et [S] = 5.10-5 M, quelle est la vitesse initiale Vi de la réaction ?
Sachant que cette enzyme, de masse moléculaire 200.000, comporte 4 protomères
identiques et une activité spécifique maximale de 25 U/mg, quelle est l’activité moléculaire
ou « turn over number » d’un site catalytique ?
Exercice 3 : Etude cinétique de l’invertase
A) Influence de la concentration en enzyme :
On réalise une série d’expériences pour des concentrations croissantes en enzyme. Les
autres conditions opératoires : température 25°C, pH, concentration initiale en substrat sont
les mêmes pour chaque essai. Chaque essai est réalisé en introduisant dans un tube :
1 cm3 de solution d’enzyme de concentration molaire CE (M)
1 cm3 de solution tampon
1 cm3 de solution de substrat en concentration saturante
On dose le glucose apparu à intervalles de temps réguliers. Les résultats sont reportés dans
le tableau suivant :
CE (M)
10-6
3,6.10-6
5,6.10-6
Temps (min)
0,8
2,9
5,0
2,5
P (nombre de µmol de glucose apparu par tube)
1,5
2,5
3,3
4,1
5,0
5,8
5,8
8,7
11,5
14,4
16,8
18,4
10,0
15,0
17,8
19,5
21,0
21,7
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
6,6
19,5
22,0
20,0
a) Tracer sur un même graphique les courbes représentatives de P = f (t) pour chacune
des concentrations en enzyme. Commentez l’allure de ces courbes.
b) Déduire des courbes précédentes les vitesse initiales Vi de la réaction pour chacune
des concentrations d’enzyme.
c) Tracez la courbe Vi = f (CE). Interprétez l’allure de la courbe.
d) L’unité d’invertase est définie comme étant la quantité d’enzyme qui hydrolyse 1 µmol
de saccharose par minute à 25°C. Sachant que la masse molaire de l’enzyme est
égale à 250.000 g/mol, calculez l’activité spécifique de l’enzyme.
e) On réalise un essai à partir d’un extrait cellulaire renfermant l’enzyme. Cet extrait
contient 300 mg de protéines pour 100 ml. Sachant que dans les mêmes conditions
que précédemment il apparait 3,6 µmol de glucose en 4 minutes de réaction :
- Calculez l’activité (relative) de 1 ml de cet extrait
- Calculez la concentration molaire de cet extrait
- En déduire le pourcentage en masse d’enzyme pure dans les protéines de
l’extrait.
B) Influence de la concentration en substrat :
On réalise une série d’expériences pour des concentrations croissantes de substat, les
autres conditions opératoires étant identiques pour tous les essais. Chaque essai est réalisé
de la manière suivante :
1 cm3 de solution d’enzyme de concentration identique pour tous les essais
1 cm3 de solution tampon
1 cm3 de solution de substrat en concentration saturante
On dose le glucose apparu et les résultats sont consignés dans le tableau suivant :
[S] dans le milieu
10-2
2. 10-2
3. 10-2
4. 10-2
10. 10-2
15. 10-2
Vi (µmol/min)
0,36
0,6
0,8
0,92
1,28
1,4
a) Tracez la courbe 1/Vi = f (1/[S]). Déduire graphiquement Vmax.
b) Quelle est l’activité (relative) de 1 cm3 de la solution d’enzyme utilisée ?
c) Déterminer la concentration molaire de la solution d’enzyme utilisée.
Exercice 4
La phosphotransacétylase catalyse la réaction suivante
AcétylCoA + Pi
Acétylphosphate + CoA-SH
et accessoirement, la réaction
PropionylCoA + Pi
Propionylphosphate + CoA-SH
1) On mesure Vi (µmoles d’ester clivé par mg de protéine) en présence de différentes
concentrations initiales d’AcétylCoA et de PropionylCoA, avec la phosphotransacétylase de
Bacillus subtilus. Les résultats sont consignés dans le tableau suivant :
[AcétylCoA]×105 (M)
2,5
5
7,5
10
25
Vi (µmol/min/mg)
0,943
1,460
1,788
2
2,597
[PropionylCoA]×104 (M)
1
2,5
5
7,5
10
Vi (µmol/min/mg)
0,363
0,568
0,699
0,752
0,793
A l’aide de la représentation de Lineweaver et Burk, déterminer KM et Vmax pour les deux
substrats.
Exercice 5
S et I sont respectivement un substrat et un inhibiteur d’une enzyme. On mesure Vi
(moles de substrat transformé par min) pour différentes concentrations initiales de S, en
l’absence et en présence de I (à la concentration de 10-6 M) :
[s] × 10-2 (M)
2
5
7,5
10
20
1)
2)
3)
4)
Vi en absence de I (µmol/min)
5
7,14
7,87
8,34
9,09
Vi en présence de I (µmol/min)
2,5
3,57
3,95
4,17
4,54
Porter 1/Vi en fonction de 1/[S] en l’absence et en présence de I.
Préciser le type d’inhibition exercé par I sur l’enzyme
Déterminer KM et Vmax en l’absence et en présence de I.
Calculer la constante de dissociation Ki du complexe enzyme-Inhibiteur.
Exercice 6
La phosphofructokinase catalyse la réaction suivante :
D-fructose-6-phosphate + ATP
D-fructose-1,6-bisphosphate + ADP
On mesure Vi (unités arbitraires) en présence de différentes concentrations initiales d’ATP
avec la phosphofructokinase érythrocytaire humaine qui est une enzyme allostérique. Les
données sont consignées dans le tableau ci-dessous :
[ATP] × 10-4 (M)
2,21
2,50
2,75
3,00
Vi × 10-3 (unité arbitraire)
15,7
22,0
25,0
27,5
a) Porter Log Vi / (Vmax – Vi) en fonction de Log [ATP]. On donne Vmax = 0,03
b) Déterminer la pente n
Exercice 7
La transaminase catalyse la réaction suivante :
Glutamate + Oxaloacétate
α-cétoglutarate + Aspartate
a) Ecrire les formules développées des différents réactants.
b) Le pyridoxal phosphate (PLP) agit comme un coenzyme dans cette réaction.
Proposer une structure simplifiée de l’intermédiaire covalent formé au cours de l’acte
catalytique.
c) Calculer le KM du complexe apoenzyme-coenzyme en utilisant les données
cinétiques ci-dessous obtenues en faisant varier la concentration en PLP pour des
concentrations fixes en glutamate et en oxaloacétate. La vitesse (Vi) correspond à la
quantité (mg) de glutamate transformée par min.
Vi (mg/min)
[PLP] (µM)
0,17
0,30
0,27
0,50
0,43
1,0
0,65
2,0
0,73
3,0
0,78
4,0
0,79
5,0
0,81
10,0
d) Exprimer la vitesse en unité d’enzyme (UI). PM (PLP) = 216 g/mol ; PM (glutamate) =
147 g/mol.
EXERCICE 8
La protéase du virus du SIDA possède une paire catalytique composée de deux
carboxylates. Un résidu Aspartate (Asp) provenant de chaque domaine notamment Asp 25
de pKa = 3,3 et Asp 25’ de pKa = 5,3.
Lors de la première étape de l’acte catalytique, un aspartate agit comme une base en
acceptant un proton de l’eau, et l’autre joue le rôle d’acide en donnant un proton au
carbonyle de la liaison peptidique hydrolysée. L’intermédiaire tétraédrique formé n’est pas lié
de manière covalente à l’enzyme.
a) Proposer un mécanisme catalytique pour cette protéase.
b) En déduire le pH optimum de cette enzyme.