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BIOPATHOLOGIE : méthodes d’immunochimie -­‐ Rattner – 5/11/12 . METHODES D’IMMUNOCHIMIE :
Les méthodes d’immunochimie sont des réactions utilisées afin de permettre la détection et la quantification de molécules en très faible quantité appelées analytes. La détection se fait en général dans les milieux biologiques. Ces méthodes sont basées sur la spécificité de la réaction antigène-­‐anticorps (Ag-­‐Ac). Le domaine d’application est vaste : •
Diagnostic de maladies infectieuses (détecter des bactéries, des virus, des champignons, des parasites) Il se fait de 2 manières : -­‐ par diagnostic indirect (recherche des Ac spécifiques générés dans le sérum) -­‐ par diagnostic direct (recherche directement l’agent infectieux ds les liquides biologiques ou dans des biopsies cad sur un tissu) •
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Diagnostic de pathologies touchant le système immunitaire : déficit immunitaire, maladies auto-­‐immunes (polyarthrite rhumatoïde), pathologies qui créent une hypersensibilité (allergies)… Dosage quantitatif de biomolécules (en milieu hospitalier, c’est tout le secteur de la biochimie) : dosage d’hormones, de médicaments, de vitamines, de protéines pathologiques déclenchées dans des processus inflammatoires RAPPELS :
ü Antigène : Toute substance naturelle ou synthétique qui est reconnue par les cellules du système immunitaire. ü Epitope ou déterminant antigénique : Ce sont des zones d’intérêt particulier sur une partie limitée de l’Ag qui va être reconnue par une partie de l’Ac (paratope). Il a une structure tridimensionnelle qui est complémentaire au site de liaison avec l’Ac. La plupart des Ag possèdent plusieurs épitopes, le tout sera alors responsable d’une réponse polyclonale. Les épitopes sont généralement conformationels (car structure 3D) mais il existe aussi des épitopes séquentiels (séquences successive sur la structure primaire). ü Haptène : Ce sont des molécules de faible poids moléculaire (<5000 Da) qui peuvent induire la synthèse d’Ac spécifiques lorsqu’ils sont couplés à une protéine porteuse (albumine, adjuvant de Freud…). Cet haptène est incapable de générer lui-­‐même une production d’Ac. Un haptène ne possède donc qu’un seul épitope. ü Réaction Ag – Ac : In vitro, elle peut se produire quand on ajoute un Ac homologue à son Ag. On obtient alors le complexe Ag -­‐ Ac qui est spécifique. Cette réaction est spécifique et réversible. La spécificité est due à la reconnaissance stérique de l’Ag (épitope) et de l’Ac (paratope). La réversibilité est possible car la combinaison entre ces 2 molécules se fait par des liaisons de faible énergie. Ag + Ac homologue Ka Kd Ag-­‐Ac Ka : constante d’association Kd : constante de dissociation 1 BIOPATHOLOGIE : méthodes d’immunochimie -­‐ Rattner – 5/11/12 . 2 ü Structure des anticorps : Ils font partie de la famille des immunoglobulines. Ils sont composés de 2 chaines légères, appelées L (« light »), et de 2 chaines lourdes, appelées H (« heavy ») ; reliées par des ponts disulfure. Aux extrémités, il y a des zones variables (V) qui sont les sites de fixation aux Ag, cad la où se feront les réactions. Le reste est composé de zones constantes (C). Il existe 5 classes d’immunoglobulines : IGG, IGM, IGA, IGD, IGE Celles qui intéressent le plus ce cours sont les IGG, cad les Ac classiques, protecteurs, retrouvés dans le sérum. ü Paratope : C’est la partie de l’Ac qui est mise en contact avec l’épitope. Sa structure spatiale constitue une niche qui va permettre à l’Ag de venir se positionner : c’est donc le lieu de la réaction spécifique. On n’utilise pas toujours les Ac entiers, on a parfois recours à des fragments d’Ac générés par des enzymes protéolytiques. Les fragments sont produits par des enzymes qui permettent une coupure modérée, ménagée de la molécule. On distingue 2 types de fragments : •
Ceux obtenus par la papaïne : elle coupe la molécule au dessus du pont disulfure. On obtient 3 fragments : -­‐ 2 fragments FAB identiques, porteurs du site de liaison pr l’Ag -­‐ 1 fragment FC (fragment cristallisable) qui comporte les fonctions effectrices comme la fixation au complément, aux récepteurs FC •
Ceux obtenus par la pepsine : il y a plusieurs sites de protéolyse en dessous des ponts disulfure et l’on génère un seul fragment utile : Le fragment F(ab’)2. Le fragment FC est dégradé. BIOPATHOLOGIE : méthodes d’immunochimie -­‐ Rattner – 5/11/12 . 3 ü Anticorps polyclonaux : Ce sont des Ac constitués d’un mélange d’Ac produits par des lymphocytes B différents. Ils peuvent résulter : o de l’injection à l’animal d’une protéine non purifiée o ou plutôt de l’injection à l’animal d’une protéine purifiée : par exemple si un Ag possède X épitopes, on va récupérer les Ac différents qui correspondent à ces X épitopes. Le sérum produit va donc reconnaitre le même Ag mais avec des affinités différentes selon l’épitope qui a été impliqué. Avantage : Ce sont des Ac qui ne sont pas très cher, avec un mode de production simple. Inconvénient : Leur spécificité n’est pas très étroite. ü Anticorps monoclonaux : Ce sont des Ac constitués d’une population moléculaire homogène avec une monospécificité pour un épitope donné. Ils sont produits de manière beaucoup plus onéreuse par des cellules en culture. Leur lieu de synthèse spécifique est l’hybridome, qui est une cellule qui résulte de la fusion d’une cellule du myélome (prolifération illimitée) avec un lymphocyte B qui provient d’une souris immunisée vis-­‐à-­‐vis de la protéine pure injectée. L’Ac résultant est non précipitant, mais sa spécificité est bien plus importante que les Ac polyclonaux. A. Les méthodes d’agglutination :
Cette méthode permet de visualiser directement (méthode macroscopique) le complexe Ag-­‐Ac. Ceci est possible parce que l’Ag est placé à la surface de grosse particules (= éléments figurés) et les Ac peuvent donc provoquer leur agglutination. On utilise 2 types de particules : •
Des particules naturelles (directement la bactérie, le parasite, ou l’hématie (hémaglutination)) •
Des particules synthétiques (billes de latex recouvertes d’Ag) Il existe des méthodes soit directes soit indirectes. Elle est particulièrement utilisée pour le sérodiagnostic des infections microbiennes et le typage des groupes sanguins (hémaglutination). BIOPATHOLOGIE : méthodes d’immunochimie -­‐ Rattner – 5/11/12 . B. Les méthodes de précipitation :
4 Dans ces méthodes, Ag et Ac se présentent sous forme soluble. Les Ag doivent être porteurs de plusieurs sites antigéniques et les Ac, de plusieurs sites paratopes. Les fragments FAB (possédant un seul site paratope) ne peuvent pas être utilisés pour cette méthode. Ces méthodes de précipitation sont utilisées de 2 manières : en milieu liquide et en milieu gélifié. 1. En milieu liquide :
* Test de l’anneau :
C’est le test qualitatif le plus simple. Protocole : On a besoin d’un tube capillaire de faible diamètre. → Introduction de l’Ac → Ajout de l’Ag soluble On voit apparaitre à l’interface un anneau de précipitation si la réaction est spécifique. * Méthode d’HEIDELBERGER KENDALL :
Elle met à profit le principe du test de l’anneau pour une méthode quantitative. Protocole : On met dans des tubes des Ac de concentration constante. → Introduction d’une quantité croissante d’Ag dans ces tubes → Ajustement du volume avec solution tampon pour avoir dans chaque tube le même volume final. On voit une précipitation mais le précipité ne se fait pas dans chaque tube, ni de façon proportionnelle avec la quantité d’Ag ajoutée. BIOPATHOLOGIE : méthodes d’immunochimie -­‐ Rattner – 5/11/12 . 5 On quantifie le précipité et on le reporte sur une courbe. On obtient une courbe en cloche dont on distingue 3 zones : o
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o
Une zone d’excès d’Ac : première partie de la courbe (quantité faible d’Ag) avec peu de précipité. Une zone d’équivalence : partie médiane de la courbe (quantité moyenne d’Ag) avec une quantité de précipité maximal. Une zone d’excès d’Ag : dernière partie de la courbe (quantité importante d’Ag) avec peu de précipité. Parfois, on obtient une courbe type cheval avec 2 zones où il n’y a pas de précipité du tout (zones d’excès d’Ac et d’Ag). Ceci est obtenu quand on a des Ac polyosidiques par exemple. Courbe type « cheval » BIOPATHOLOGIE : méthodes d’immunochimie -­‐ Rattner – 5/11/12 . Le dosage doit se situer dans un contexte contrôlé : * Facteurs influençant l’immunoprécipitation :
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facteurs physico chimiques (pH, température, force ionique) agissent au niveau des liaisons de faible énergie. On peut utiliser le polyéthylène glycol (PEG) qui est un agent précipitant (polymère non ionique = non chargé). Il accélère la précipitation car elle n’est pas instantanée voire lente. L’inconvénient de la réaction Ag-­‐Ac est que ce n’est pas une réaction instantanée d’où l’intérêt du PEG pour un diagnostic plus rapide. * Les méthodes de quantification :
Le principe des mesures :
Il doit prendre en compte ce phénomène de zone. Pour une même quantité de précipité détectée, on peut mesurer une quantité d’Ag X1 ou X2. Ce principe veut que l’on se place ds la zone ascendante de la courbe cad lorsque la quantité de précipité augmente avec la quantité d’Ag. On doit alors préparer plusieurs dilutions d’Ag. La turbidimétrie / néphélométrie :
La quantification est basée sur le principe selon lequel la lumière, passant par un milieu contenant des particules dispersées d'un indice différent de celui du milieu, diminue en intensité du fait d'un phénomène de dispersion. La turbidimétrie mesure seulement de la lumière transmise, dans le même axe. La néphélométrie mesure la lumière diffusée dans une direction donnée : on se place pour la détection à un angle de 7 à 10 degrés par rapport à la lumière diffusée. 6 BIOPATHOLOGIE : méthodes d’immunochimie -­‐ Rattner – 5/11/12 . 7 Les deux méthodes sont utilisées en permanence, à haut rendement. La néphélométrie est plutôt la méthode de référence pour le dosage des protéines sériques, alors que la turbidimétrie est un analyseur qui fonctionne 24h/24 pour des dosages auxquels on doit répondre à tout moment. La limite de la méthode par turbidimétrie est qu’elle est limitée par l’excès de lipides dans les liquides biologiques (alimentation parentérale, certaines pathologies qui troublent les liquides biologiques…) Milieu gélifié :
* Méthode d’immunodiffusion radiale (IDR) : méthode de Mancini
Protocole : On a une boîte de Pétri ds laquelle on coule de la gélose qui contient l’Ac, qui est donc homogène. On creuse des puits dans lesquels on place des Ag en concentration connue qui correspondent à la gamme étalon puis des Ag de concentration inconnue (objet du dosage). Par diffusion passive, l’Ag diffuse jusqu’à la zone d’équivalence. On va alors mesurer le diamètre des disques de précipitation pour les données quantitatives. Sur la courbe, on reporte le carré du diamètre du disque de précipitation : on obtient une relation linéaire entre le carré du diamètre des disques de précipitation et la concentration d’Ag. Enfin, pour doser la concentration d’un Ag, on mesure son diamètre de précipitation et on reporte son carré sur le graphique. Grâce à la courbe étalon, on peut en déduire sa concentration. BIOPATHOLOGIE : méthodes d’immunochimie -­‐ Rattner – 5/11/12 . 8 * Electrophorèse en fusée ou technique de LAURELL:
C’est une technique plus complexe qui fait appel à une méthode de séparation. Intérêt : la précipitation est plus rapide Protocole : On dispose d’une plaque de gélose qui contient l’Ac réparti uniformément. On creuse des puits dans lesquels on va mettre les Ag étalons ou à doser. On applique le champ électrique. Les protéines vont migrer vers le pole + car le pH = 8,6. On se place dans des conditions spécifiques où l’Ag ne migre pas contrairement aux Ac : on obtient alors des arcs de précipitation. C’est la hauteur de l’arc qui est proportionnelle à la concentration en Ag. Ces méthodes permettent une visualisation directe sans révélation du complexe Ag-­‐Ac. BIOPATHOLOGIE : méthodes d’immunochimie -­‐ Rattner – 5/11/12 . 3. Immunodosages utilisant un marqueur :
9 Principe :
L’Ag est fixé sur un support. On ajoute un Ac primaire qui se fixe à l’Ag. Ce complexe Ag-­‐Ac nécessite pour être détecté la présence d’un 2ème Ac ou Ac secondaire conjugué à un marqueur (marqueur lié par une liaison de covalence) : c’est ce complexe ternaire qui va être détecté. Nature du marqueur :
Il y a différents types de marqueurs : •
Les radioéléments sont utilisés depuis de nombreuses années. Il s’agit de radio-­‐immuno-­‐essais (RIA). Cependant, détecter les éléments radioactifs reste complexe (tritium, iode 125) On continue à les utiliser car leur sensibilité est extrême, ce sont des produits très fiables. •
Les marqueurs de type enzymes : ce sont les enzyme-­‐immuno-­‐essai (EIA). Ils utilisent la phosphatase alcaline, l’HRP, la glucose 6 phosphate déshydrogénase, la β galactosidase Il va falloir détecter ces enzymes selon 2 principes : o
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par réaction avec un substrat : on détecte le produit de la réaction par une enzyme couplée directement avec un fluorophore 1) L'anticorps primaire se fixe à l'antigène. 2) L'anticorps secondaire (conjugué à un marqueur) se fixe à l'anticorps primaire. Détection :
3 types de détecteurs sont utilisés : o
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Spectrophotomètre si il s’agit d’une réaction colorée. Fluorimètre si le signal émis est fluorescent. Luminomètre si la réaction dégage un réactif fluorescent (HRP), par exemple le luminol. Amplification :
Si le signal direct est trop faible, on utilise une méthode afin de l’améliorer: c’est la méthode streptavidine-­‐biotine, qui est détectée par la peroxydase. BIOPATHOLOGIE : méthodes d’immunochimie -­‐ Rattner – 5/11/12 . Méthode immunoenzymatique de type streptavidine-­‐biotine-­‐peroxydase : 10 1) L'anticorps primaire (bleu) se fixe à l'antigène (noir). 2) L’anticorps secondaire (vert) se fixe à l'anticorps primaire (mais il n’est pas directement marqueur) et porte une molécule de biotine (flèche rouge). 3) La biotine fixe un complexe streptavidine-­‐peroxydase (croix jaune) car l’affinité de la streptavidine est très forte pour la biotine. 4) Lavidine est alors détectée et permet une amplification du signal. à C’est une réaction très fiable car elle n’est pas réversible. A partir de ce principe, on fait des dosages soit en phase hétérogène, soit en phase homogène. Dosage en phase hétérogène :
Il nécessite une étape de séparation du complexe Ag-­‐Ac avant la détection et répond à 2 principes de base : le dosage ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) : • soit avec un excès d’Ac : C’est la Méthode sandwich. On dispose d’un support solide avec à sa surface des molécules d’Ac fixés en excès de manière irréversible. Elle nécessite 2 Ac : -­‐ Un Ac liant, fixé sur le support. -­‐ Un Ac marqué, qui sert de révélateur. Lorsqu’on met en contact l’Ac fixé en excès avec l’Ag à doser, au bout de 1 à 3 heures, on observe une fixation. On élimine par lavage ce qui n’a pas été fixé. Puis on ajoute l’Ac marqué. On élimine de nouveau les molécules non fixées (marqueur libre). On quantifie ensuite le signal : il y a proportionnalité entre la concentration d’Ag et le signal de la fraction liée. Ce principe n’est pas applicable lorsqu’on veut doser des haptènes car cela nécessite d’avoir 2 épitopes différents. BIOPATHOLOGIE : méthodes d’immunochimie -­‐ Rattner – 5/11/12 . •
11 soit avec Ac limitant : Méthode par compétition : L’Ac fixé est limitant. On ajoute l’Ag à doser et l’Ag marqué. L’Ag marqué déplace par compétition l’Ag à doser. Après lavage on voit que plus la concentration d’Ag augmente, plus le signal diminue. On a donc une relation exponentielle entre la concentration d’Ag et le signal de la fraction liée. Cette méthode est applicable à tous les Ag quelque soit leur taille. Elle nécessite un travail sur des plaques multi puits (96 puits). Si la méthode n’est pas assez sensible (signal émis trop faible), on couple à une réaction streptavidine. Les spots colorés indiquent que la réaction est spécifique Exemple : La bandelette réactive : L’idée de la méthode Elisa se retrouve dans d’autres méthodes comme le test de grossesse par exemple. Ce test met en évidence de la gonadotrophine chorionique humaine hCG dans les urines. Il nécessite : •
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L’anticorps de capture immobilisé de façon covalente à la surface de la bandelette. L’anticorps traceur marqué avec un colorant et imprégné sur la surface de la bandelette, mais mobile. La bandelette, matériau adsorbant. Un échantillon d’urine déposé à la surface, le liquide se déplace à travers la bandelette par capillarité. •
Les réactions de l’essai ont lieu dans un flux. BIOPATHOLOGIE : méthodes d’immunochimie -­‐ Rattner – 5/11/12 . 12 Exemple : Méthode ELISPOT : Principe : capturer des molécules sécrétées par des cellules (généralement des cytokines), sur un support solide sensibilisé qui permet la culture des cellules. Il s’agit d’une membrane de nitrocellulose sur laquelle sont fixés des Ac. Cela permet la réalisation in situ d’une culture de cellules. Il faut attendre un certain temps (24h) pour que les cellules viennent sécréter les cytokines. On effectue ensuite un lavage pour éliminer les cellules. Si les cytokines sont spécifiques des Ac, elles se fixent. La révélation se fait par un Ac secondaire couplé à un système qui permet la précipitation. Apparaissent alors des spots de précipitation. Cette méthode est beaucoup utilisée dans les pathologies auto-­‐immunes, dans le développement de vaccins, et dans les maladies infectieuses. Les méthodes de dosage en phase hétérogène sont compliquées à cause de l’automatisation pour les lavages. BIOPATHOLOGIE : méthodes d’immunochimie -­‐ Rattner – 5/11/12 . 13 Dosage en phase homogène :
Exemple : La Méthode EMIT (Enzyme multiplied immunoassay technique) : Principe : Il n’y a pas de séparation entre Ag et Ac. La fixation de l’enzyme sur son ligand va modifier son activité en l’activant ou en l’inhibant. Dans cet exemple : Lorsque l’enzyme est liée à l’Ag, elle est inactive. Il s’agit d’une méthode par compétition : on ajoute la molécule à doser. On va alors déplacer les molécules qui portent l’enzyme. A chaque fois qu’elles seront libres, ces molécules seront activées. Il n’y a pas besoin de séparer Ag et Ac, il suffit de rajouter ds le milieu réactionnel un substrat spécifique de l’enzyme. Le produit de la réaction est mesuré par spectrophotométrie (mesure de l’absorbance). 4. Méthode d’analyse des protéines sériques :
Réalisation pratique :
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Séparation des protéines sériques ou urinaires par électrophorèse sur gel (agarose, acrylamide) et de plus en plus par électrophorèse capillaire. •
Les protéines sériques (albumine et globulines) donnent 5 ou 6 fractions → Albumine → α1,α2,β1,(β2),γ globulines → En analyse courante, on s’intéresse aux variations des taux qui donnent des informations sur les organes qui les synthétisent. BIOPATHOLOGIE : méthodes d’immunochimie -­‐ Rattner – 5/11/12 . o
Σ hépatique: albumine, α1,α2,β1,(β2) o
Σ par lymphocytes B activés:γ 14 Ceci est un profil électrophorétique. Un taux de variation va demander des analyses supplémentaires pour obtenir le type de pathologie. On obtient dans tous les cas un pic d’albumine majeur, soit à droite soit à gauche selon la migration. Par exemple, pour les γ globulines : si on observe une modification, on va effectuer une étape d’immunotypage qui fait appel à des Ac. Electrophorèse capillaire :
Un capillaire, 2 électrodes, une source de courant haut tension, un détecteur et un appareil de récupération et de traitement des données. 2 solutions tampons. La migration des analytes se met en place grâce à un champ électrique appliqué entre les 2 solutions tampons fourni par le générateur haute tension. Tous les ions, positifs ou négatifs sont attirés à travers le capillaire dans le même sens par le flux électroosmotique. Les analytes sont séparés pendant leur migration du fait de leurs mobilités électrophorétiques différentes, et sont détectés à proximité de la sortie du capillaire. Le signal du détecteur est envoyé à un appareil qui reçoit et traite ces données pour les faire apparaître sous la forme électrophorégramme (les composés chimiques séparés apparaissent comme des pics avec des temps de rétention différents). Protéines au pH physiologique chargées négativement. Le transport des espèces à séparer, de mobilité µapp : -­‐ résulte de leur mobilité propre µep (flux électrophorétique), fonction de la charge et de la taille de l'espèce, -­‐ et de la mobilité du tampon µeo, (flux électroosmotique), fonction du pH et de l'électrolyte. BIOPATHOLOGIE : méthodes d’immunochimie -­‐ Rattner – 5/11/12 . 15 Intérêt : C’est une microtechnique (très peu d’échantillon biologique), automatisée en milieu hospitalier, rapide, de haute résolution, avec une très grande sensibilité de la détection. La séparation est rapide et fine : on obtient un profil électrophorétique. L’immunosoustraction :
Technique analytique permettant le typage d’un pic monoclonal en électrophorèse capillaire. Protocole: •
On ajoute au sérum des anticorps fixés à des billes : anti-­‐IgG, anti-­‐IgM, anti-­‐IgA,(chaînes lourdes), anti-­‐κ, anti-­‐λ (chaînes légères). •
Les complexes Ag-­‐Ac précipitent et on réalise l’électrophorèse capillaire sur le surnageant. •
On visualise alors une disparition de la fraction correspondant à l’anti-­‐sérum utilisé (cad là où la réaction était positive). On observe un pic anormal des γ globulines au niveau des IGM et des λ Conclusion : Ce patient présente une γ pathie IgM λ monoclonale. Parfois ce genre de technique n’est pas suffisante pr le diagnostic. Il y a alors une autre méthode disponible : c’est l’immunofixation. L’immunofixation :
Protocole : •
Séparation des protéines par électrophorèse dans un gel •
Principe : faire migrer le sérum à tester plusieurs fois (il faut autant de pistes que d’Ac à utiliser dans la deuxième étape) •
Ac ajoutés sur chaque piste de migration •
Lavage pour éliminer les molécules non reconnues par les Ac •
Coloration des complexes Ag/Ac •
Application : diagnostic de monoclonalité des immunoglobulines BIOPATHOLOGIE : méthodes d’immunochimie -­‐ Rattner – 5/11/12 . 16 Exemple : → Incubation avec des antisérums (anti-­‐IgG, anti-­‐IgM, anti-­‐IgA, anti-­‐κ, anti-­‐λ) : il y a précipitation des complexes Ag-­‐Ac. → Révélation des complexes par un colorant. Là où il y a une précipitation abondante, on observe une bande plus marquée : IgM et λ. Intérêt : méthode rapide (moins de 2h), qui ne nécessite pas un matériel particulier, avec une lecture facile. POINT Charline & PONCET Noellie