Mécanismes physiopathologiques de la persistance au cours des IOA Frédéric Laurent CRIOAc Rhône-Alpes Auvergne Laboratoire de bactériologie, Hôpital de la Croix Rousse, Hospices Civils de Lyon Centre National de Référence des Staphylocoques CIRI-INSERM U1111 Equipe ”Pathogénèse des infections à staphylocoques”

Physiopathologie des IOA

IOA aiguë récurrence et chronicité observée chez de nombreux patients Biofilm Internalisation 09/12/2014 1

Physiopathologie des IOA

IOA aiguë récurrence et chronicité observée chez de nombreux patients Biofilm

Internalisation

09/12/2014

Internalisation

2

Internalisation

Ahmed S et al, Infect Immun. 2001

Rcp fibronectine +

S. aureus

Ostéoblaste MG3

Rcp fibronectine -

09/12/2014

Internalisation

Invasion des ostéoblastes par

S. aureus

S. aureus FnBP Formation d’une vacuole d’internalisation ou phagosome Fibronectine N°6 intégrine

α5β1

Membrane cellulaire Traction du cytosquelette Invagination membranaire

Microscopie électronique à balayage Hoffmann

et al.,

Eur J Cell Biol 2011 6 3

Internalisation

Persistance intracellulaire

Bactéries (points noirs) internalisées dans les ostéocytes entourés par des lamelles osseuses. (Internalization of

S. aureus

by osteoblasts in a patient with long term recurrent osteomyelitis JBJS 2005) 7

Internalisation

Marquage sélectif / microscopie à fluorescence

N°8

Ostéoblaste MG3

S. aureus

extracellulaires

S. aureus

intracellulaires 10 µm

S. aureus

marqués au Bodipy FL Actine marquée à la rhodamine - phalloïdine 09/12/2014 4

Internalisation

Gentamicin-lysostaphin protection assay

(GLPA)

GENTAMICIN LYSOSTAPHIN 0h INFECTION INVASION LDH RELEASE SELECTIVE KILLING OF EXTRACELLULAR BACTERIA MEMBRANE LEAKAGE IN DAMAGED CELLS OSMOTIC CELL LYSIS & BACTERIAL RELEASE 24h 2h 3h Lignée cellulaire MG-63 MOI: 100 bactéries / OB

Internalisation

Internalisation initiale SARM-Communautaires vs SARM-Hospitaliers

N°10

09/12/2014 La charge bactérienne est de ≈

1 SARM-C / cellule

vs ≈

5 SARM-H / cellule

5

II - INVASION DES OB PAR LES SARM

Internalisation

Cytotoxicité des SARM-Communautaires et SARM-Hospitaliers 24h après internalisation

N°11

09/12/2014 Dommages causés aux cellules infectées :

SARM-C >> SARM-H

II - INVASION DES OB PAR LES SARM

Internalisation

Survie intracellulaire des SARM-C et SARM-H après 24h

N°12

Survie intracellulaire :

SARM-H >> SARM-C

6

II - INVASION DES OB PAR LES SARM

Pourcentage de mortalité des ostéoblastes (mêmes expériences que précédemment)

N°13

ST80 EMRSA2 ≈ 1 SARM-C / cellule 50% de mortalité chez les OB après 24h ≈ 5 SARM-H / cellule 20% de mortalité chez les OB après 24h

Internalisation

S. epidermidis vs S. aureus

09/12/2014 7

Internalisation

• Internalisation = sanctuarisation des bactéries - protection vis à vis du système immunitaire - protection vis à vis des ATB • Capacités d’invasion et de survie intracellulaire variables d’une espèce à l’autre et d’une souche à l’autre . rôle de l’internalisation dans la persitance = variable . symptomatologie clinique et évolution clinique différentes d’un patient à l’autre

N°15

09/12/2014

Physiopathologie des IOA

IOA aiguë récurrence et chronicité observée chez de nombreux patients Biofilm

Internalisation

8

Physiopathologie des IOA

IOA aiguë récurrence et chronicité observée chez de nombreux patients

Biofilm

Internalisation 09/12/2014

Biofilm

Wikipedia • Un biofilm est une communauté multicellulaire plus ou moins complexe, souvent symbiotique, de micro-organismes (bactéries, champignons, algues ou protozoaires), adhérant entre eux et à une surface, et marquée par la sécrétion d'une matrice adhésive et protectrice.

• Il se forme généralement dans l'eau ou en milieu aqueux. Le biofilm est une étape normale ou potentielle du cycle de vie de la plupart des bactéries, qui affichent alors un comportement coopératif et produisent des phénotypes différenciés conduisant à des fonctions spécifiques, parfois en réaction à un stress.

9

09/12/2014

Biofilm

19 • Bactérie d’origine - hématogène - inoculation - contiguité

Biofilm

20 10

Biofilm

Biofilm et impact sur la physiopathologie des IOA

Prothèse Tissu Sequestre

(cassure d’une couche épaisse de biofilm d’un séquestre infecté)

Evans et al., Clin Orthop. 1998,

Tissu ostéomyélite

Johansen et al., J. Comp Patho., 2012

Biofilm

Le biofilm : « substance visco-élastique » • Matériel ou os nécrosé • Exopolysaccharides bactériens • Organisation en colonies • Répartition hétérogène des bactéries • Canaux de circulation (nutrition, élimination) • Stratification de colonies bactériennes • Métabolisme bactérien adapté • Associations bactériennes fréquentes 09/12/2014 11

De l’adhérence au biofilm …

Expression d’adhésines de surface 09/12/2014

De l’adhérence au biofilm …

Matrice extracellulaire Extracellular polymeric substance (EPS) 12

De l’adhérence au biofilm …

Aap = Adhesion-associated-protein AtlE = Autolysine E Bap = Bone-associated-protein LTA = Lipo-Teichoic Acid

S. epidermidis

PGA = Poly-gamma-Glutamyl Acid PNAG = Poly-N-acetyl-glucosamine ; Sdr = Serin domain repeat WTA = Wall Techoic Acid

Otto, M.

Nat Rev Microbiol, 2009.

Biofilm et infection sur matériel

Bactéries planctoniques : . élimination par les mécanismes de défense naturels (anticorps, phagocytes…) . Facilement accessibles aux antibiotiques × Antibiotique Anticorps Enzymes phagocytes Bactéries planctoniques Bactérie Biofilm JW Costerton (1999) Science, 284:1318-1322 09/12/2014 13

Biofilm et infection sur matériel

Bactéries séssiles = adhésion sur une surface inerte et entre elles un biofilm

. résistante aux anticorps . aux phagocytes . à certains antibiotiques

× Antibiotique Anticorps Enzymes phagocytes Bactéries planctoniques Bactérie Biofilm JW Costerton (1999) Science, 284:1318-1322

Biofilm et infection sur matériel

• phagocytes attirés par les biofilms • phagocytose

inopérante

mais enzymes phagocytaires libérées localement × Antibiotique Anticorps Enzymes phagocytes Bactéries planctoniques Bactérie Biofilm JW Costerton (1999) Science, 284:1318-1322 09/12/2014 14

Biofilm et infection sur matériel

Libération enzymes phagocytaires =

endommage les tissus autour du biofilm descellement essaimage

des bactéries planctoniques à partir du biofilm :

. dissémination de l’infection . infection dans un tissu voisin ou à distance

× Antibiotique Anticorps Enzymes phagocytes Bactéries planctoniques Bactérie Biofilm JW Costerton (1999) Science, 284:1318-1322

De

l’adhérence

au biofilm …

09/12/2014 15

Hétérogénéité du biofilm chaque bactérie = un microenvironnement spécifique Toutes les bactéries ne "voient" pas la même chose : . accès aux nutriments . pH . position dans le biofilm fonction de . proximité d’un canal . oxygène . … . proximité bactéries

Gradient physico chimique Gradient métabolique Gradient oxygène

09/12/2014 Hétérogénéité du biofilm / micro environnement 16

Hétérogénéité du biofilm / micro environnement 09/12/2014 Hétérogénéité du biofilm / micro environnement

Mesure de la synthèse protéique

Expression GFP

Mesure de la synthèse ADN

5 bromo2-deoxyuridine (BrdU) Biofilm

S. epidermidis (Rani et al.,

, 2007) 17

Hétérogénéité du biofilm / micro environnement 09/12/2014

Biofilm et antibiotiques

Streptococcus mutans

biofilm + ATB / Baclight microcolonies biofilm = le village gaulois antibiotiques = les romains

Antibiotiques

18

Biofilm et antibiotiques

Nous testons : CMI Le patient a : CMEB

Biofilm et antibiotiques

Donlan et al., CMR 2002 09/12/2014 19

Biofilm et antibiotiques

09/12/2014 Olson et al., 2002

Biofilm et antibiotiques

"Tolérance aux antibiotiques"

Résistances spécifiques

: génes de résistance • • • • • • • •

Résistances non spécifiques

: architecture du biofilm = séquestre physique des ATB ESP = barrière physique à la pénétration ESP = adsorbant ou réactant des ATB = ↓ ATB disponible Ex:

S. aureus

et PNAG et acides téchoïques métabolisme réduit = ↓ activité antibiotiques actifs sur division métabolisme anaérobie ++ = inactivité des aminiglycosides effet stress : ↑osmolarité = ↓ porines transmembranaires effet inoculum: densité biofilm >> densité planctonique induction de gènes de résistance spécifiques : pompes efflux

ndvB

Génome = "hypothetical protéine " biofilm ??? 20

Biofilm et antibiotiques

Daptomycine et résistance spécifique : exceptionnelle Daptomycine et vitesse de pénétration Biofilm

S. epidermidis

sur dispositif en flux Marquage Bodipy Daptomycine

Coeff diffusion = 28%

Stewart, AAC, 2009

Biofilm et antibiotiques

Modèle = disque de silicone colonisé

in vitro

/ ATB = 2 mg/ml 09/12/2014 Raad et al., AAC 2007 21

Biofilm

Biofilm . environnement complexe chimique et microbiologique . Sanctuarisation des bactéries: - protection contre le système immunitaire - protection contre les antibiotiques Certains antibiotiques ont un meilleur profil ”biofilm” . études nécessaires D’autres molécules, d’autres approches sont à venir . Protéger contre les phases initiales de formation . Attaquer le biofilm pour facilité la pénétration des ATB . ….

Physiopathologie des IOA

IOA aiguë récurrence et chronicité observée chez de nombreux patients

Biofilm

Internalisation 09/12/2014 22

Physiopathologie des IOA

IOA aiguë récurrence et chronicité observée chez de nombreux patients Biofilm Internalisation

Small Colony Variant

09/12/2014

SCV

Strepto B Culture de sonicat

S. aureus

« sauvage »

S. aureus

SCV 23

« small colony variant » difficulté de détection

Normale Small colony variant Von Eiff C

Physiologie des SCV

SCV

Même souche (génétiquement) En bas :

S. aureus

normale En haut :

S. aureus

SCV Particularités des micro-colonies

in vitro

: . adhérence +++ . tps de génération (doublement) x 10 . perte de l ’activité bactéricide de certains ATB . persistance des bactéries dans des niches cellulaires protectrices (ostéoblastes, cellules endothéliales , …)…. . peu de réaction inflammatoire locale . à l’origine d’échec thérapeutique SCV existent chez de nombreuses espèces :

S. aureus

, E. coli, P. aeruginosa, P. acnes,

… 09/12/2014 24

Physiologie des SCV

Auxotrophie = incapacité d'un organisme vivant à synthétiser un composé organique nécessaire à son développement. + altération large du protéome Kriegeskorte A, Protéomics 2011

SCV, IOA et diagnostic bactériologique

09/12/2014 Vesga JID 1996 25

In vitro

Physiologie des SCV

Edwards A M J. Bacteriol. 2012;194:5404-5412

09/12/2014

SCVs emerge naturally during exponential-phase of Normal Colony Population growth.

Physiologie des SCV

Modèle cellulaire Infection culture cellulaire par NCP Tuchscherr et al.,2010 EMBO Molecular Medecine 26

09/12/2014 In vivo

Physiologie des SCV

Tuchscherr et al.,2010 EMBO Molecular Medecine

Physiologie des SCV

SCV stable Culture de sonicat SCV révertant 27

Sélection des SCV

Tuchscherr et al.,2010 EMBO Molecular Medecine Pb pour le diagnostic : SCV révertants vs. SCV stables

SCV et capacité d’internalisation

09/12/2014 Tuchscherr et al.,2010 EMBO Molecular Medecine 28

SCV et virulence

09/12/2014

SCV et résistance

Comparaison des antibiogrammes : SCV plus résistants

S. epidermidis S. epidermidis

de phénotype SCV Choix thérapeutiques orientés et adaptés 29

Juin 2011 – Mars 2012

SCV et biofilm

. bactéries "collées" sur le matériel . bactéries empaquettées dans la matrice . bactéries métaboliquement peu actives avec signaux de quiescence interne au biofilm

Sonication des prothèses et matériels

SCV et biofilm

Prothèses explantées 09/12/2014 30

Juin 2011 – Mars 2012

SCV et biofilm

Prothèses explantées Culture bactérienne classique (1-10 prélèvements per-opératoires)

57 patients

5 exclus de l’étude

52 patients 17 « suspicion d’infection » 35 « descellement aseptique »

09/12/2014 31

SCV et biofilm

Résultats – Culture classique

VS

sonication (3) Apport de la sonication dans le diagnostic des SCV 17 ”suspicion d’infection” 9 cultures + 6 avec SCV +

S. aureus S. epidermidis P. aeruginosa S. gallolyticus P. acnes S. sanguinis S. aureus

« sauvage »

S. aureus

SCV Culture de sonicat

SCV et biofilm

Réplication ADN Synthèse protéique 09/12/2014 32

SCV et résistance

Questions qui reste sans réponse car aucune étude seulement des séries de quelques cas: - Faut-il traiter différemment les patients avec IOA à SCV + ?

- Faut-il préférer certains ATB ? (activité intracellulaire, intra biofilm, …) - Faut-il traiter plus longtemps? … mais combien de temps On aurait envie de répondre oui …

Conclusion

• SCV = physiologique ? Présent tout le temps ?

• Rôle physiopathologique clair in vitro et dans les modèles • Prise en charge au laboratoire: – examiner tous les aspects – Identifier tous les aspects (Maldi-tof: colonie blanches qui sont des S. aureus, Strepto non hémolytique qui sont des StreptoA, …) 09/12/2014 33

09/12/2014

Les SCV en clinique

Pr. Tristan Ferry [email protected]

Service de Maladies Infectieuses et Tropicales Hôpital de la Croix-Rousse, Hospices Civils de Lyon Université Claude Bernard Lyon1, Lyon Centre International de Recherche en Infectiologie, CIRI, Inserm U1111, CNRS UMR5308, ENS de Lyon, UCBL1, Lyon, France Centre Interrégional Rhône-Alpes Auvergne de Référence des IOA complexes 34

Von Eiff, Clin Infect Dis, 1997, 25:1250-1251 09/12/2014 35

09/12/2014 Mbio 2014 Subjects infected with S. aureus were more likely to fail (HR, 4.03, 95%CI, 1.80-9.04) 36

Comparison of bacterial growth between a wild-type strain (ATCC 51331) and a typical SCV S. maltophilia isolate from patient A on various routine agar media after 48 h of incubation at 35°C.

09/12/2014

Anderson S W et al. J. Clin. Microbiol. 2007; doi:10.1128/JCM.01444-06 BMJ case report 2013

37

Conclusion

• • • Physiopathologie des IOA encore méconnue Multiples stratégies bactériennes de persistance Mieux comprendre ces mécanismes est un enjeu important - Pour la prévention - Pour trouver de nouvelles cibles thérapeutiques 09/12/2014 38