Transcript Jean GUZZO et Aurélie RIEU (UMR PAM)

Biofilm et immunomodulation : cas
d’un Lactobacillus casei
Jean GUZZO
Aurélie RIEU
UMR A Procédés Alimentaire et Microbiologique
Université de Bourgogne/AgroSup Dijon
Equipe Valmis
Biofilm
et bactéries lactiques
Un biofilm est une matrice exopolymérique au sein
de laquelle vivent une ou plusieurs communautés
microbiennes adhérées à une surface
Protection par une matrice exopolymérique
Réserve de nutriments
Interaction bénéfique
Forte résistance aux stress et aux agents
anti-bactériens
Des supports multiples pour les bactéries lactiques
Plaque dentaire
Matrices alimentaires
Végétaux
Muqueuses
Développement d’un phénotype biofilm
Canalisations
Souche de Lactobacillus casei ATCC334
 Capable de former des biofilms
Marquage : Syto9 - ConA
Lactobacillus casei ATCC334
4h
24h
48h
 Connue pour ses propriétés anti-inflammatoires
Effet de la croissance en biofilm de Lactobacillus casei ATCC334 sur son
activité immunomodulatrice
Réponse immunitaire innée
Réponse immunitaire adaptative
Motifs microbiens
Pathogène
Gram(-)
Lumière intestinale
LPS
RRM
M
Cellule épithéliale intestinale
Possibilité
d’activation directe
Cellule
Dendritique
Macrophage
IL12
Soit pro-inflammatoire Soit anti-inflammatoire
TNF-α
TNF-α
…
Macrophage
TNF-α
IFNɣ
IL2
Voie pro-inflammatoire
IL12
Th1
Th0
IL4
Th2
IFNɣ
Voie anti-inflammatoire
Immunomodulation
Lactobacillus casei ATCC334
Modèle in vitro culture cellulaire de THP-1
Modèle d’étude in vitro de la réponse
immunitaire innée
LPS
Centrifugation
Récupération
surnageant
Macrophages (cellules THP-1)
Mesure de la
production de TNF-α
Molécules
secrétées
L. casei
Comparaison des effets anti-inflammatoires des surnageants :
- de culture de biofilm
- de culture planctonique
Modulation de la production de TNF-α par des cellules THP-1
en présence de LPS et du surnageant de L. casei
cultivées en biofilm ou en planctonique.
120
100
Témoin
Planctonique
Biofilm
TNF (%)
80
60
40
20
*
*
*
*
* p<0,05
*
*
0
Les surnageants planctonique et biofilm non dilués conduisent à une réduction significative du taux de
TNF-α produits
Le surnageant provenant de culture en biofilm est significativement plus efficace en comparaison du
surnageant planctonique
Le surnageant de biofilm de L. casei diminue la production de TNF-α de façon dose dépendante
Identification des molécules dans le surnageant
de
Lactobacillus casei ATCC334
Modèle in vitro culture cellulaire de THP-1
Mise en évidence du rôle de GroEL dans l’effet immunomodulateur
de L.casei 334 sur le modèle cellulaire THP-1
Diminution de la quantité de GroEL à l’aide d’Ac anti-GroEL
DnaK
GroEL
Génération de surnageants avec des doses diminuées de GroEL
120
100
TNF (%)
80
*
60
*
(P<0.05)
*
40
20
*
*
*
0
Déplétion avec Ac anti-GroEL
Corrélation entre la production de TNF-α et le taux de GroEL présent dans le surnageant
Structures des protéines de stress
Immunomodulation
Lactobacillus casei ATCC334
Modèle in vivo poisson zèbre
Modèle in vivo
Utilisation de larves de poisson zèbre Daniorerio
Intérêt:
Poisson transparent (image en fluorescence)
Larves avec système immunitaire (réponse innée)
Existence de nombreuses lignées (macrophages fluorescents)
Génome connue (mesure de l’expression de gènes codant des cytokines par RT-qPCR)
Criblage à grande échelle (microplaque)
2 lignées : WIK (sauvage) et Tg(fms:kaede) (macrophages fluorescents)
Ponte
Récolte des œufs
Stérilisation
PCR quantitatives
Observations
microscopiques
WIK
Extractions
d'ARN
7, 8 et 9 jpf*
Tg(fms::kaede)
Quantification de la
réponse inflammatoire
(quantification du taux
de transcrits de IL-10,
TNF- et IL-1)
Dissociation
des cellules
Broyages
Traitements :
- L. casei (108 UFC/ml)
à 5 jpf*
- TNBS à 6 jpf* (model
of inflammatory
bowel disease)
Animalerie poisson zèbre de l’Université de Bourgogne
UMR 866 INSERM
Cytométrie en
flux
Quantification de la
réponse inflammatoire
(quantification des
macrophages)
*jpf: jour post-fertilisation
Capacité de L. casei ATCC334 à coloniser l’intestin des larves
de poisson zèbre
Observation en microscopie
à épifluorescence
Observation en microscopie électronique
à balayage
microvilli
microvilli
bacteria
Témoin
50 µm
bacteria
L. casei
ATCC334 GFP
2 µm
0.5 µm
50 µm
microvilli
Implantation de L. casei dans la lumière intestinale
aux contact des microvillosités
bacteria
0.5 µm
Expression des marqueurs de l’inflammation chez le poisson zèbre
100,0
8 jpf
9 jpf
Taux de transcrits de IL-1
7 jpf
10,0
1,0
0,1
7 jpf
8 jpf
9 jpf
10,0
1,0
0,1
Témoin
L. casei 334
TNBS
TNBS + L. casei 334
Témoin
L. casei 334
100,0
Taux de transcrits de IL-10
Taux de transcrits de TNF
100,0
7 jpf
8 jpf
9 jpf
10,0
1,0
0,1
Témoin
L. casei 334
TNBS
TNBS + L. casei 334
TNBS
TNBS + L. casei 334
Comparaison du nombre total de macrophages par analyse en
cytométrie de flux et microscope à épifluorescence
L. casei 334
Germ-free
GFP-A
TNBS + L. casei 334
TNBS
GFP-A
GFP-A
GFP-A
2
7 jpf
Germ-free
8 jpf
9 jpf
L. casei 334
1,75
500 µm
TNBS
% de macrophages
1,5
1,25
500 µm
1
TNBS + L. casei 334
0,75
0,5
0,25
500 µm
0
500 µm
Témoin
L. casei 334
TNBS
TNBS + L. casei 334
Mise en évidence de la synthèse de GroEL par L. casei dans le modèle
zebrafish
bacteria
bacteria
GroEL
GroEL
GroEL
GroEL
GroEL
0.1 µm
0.1 µm
0.1 µm
microvilli
Double localisation : dans la bactérie et extracellulaire (moonlighting proteins)
Conclusions
Colonisation et attachement de L. casei ATCC334 au niveau de l’intestin du poisson
zèbre (Mise en place d’un biofilm?)
Modulation de la réponse immunitaire avec un effet anti-inflammatoire in vivo dans
le modèle larves de poisson zèbre (Immunité innée)
Modulation de la réponse immunitaire avec un effet anti-inflammatoire in vitro sur
modèle cellulaire THP-1 différenciées en macrophages (Immunité innée)
Effet bénéfique de la culture en biofilm
Mise en évidence de l’implication du chaperon universel Hsp 60 (GroEL)
UMR A Procédés Alimentaire et Microbiologique
Université de Bourgogne/AgroSup Dijon
Equipe Valmis
Jean Guzzo
Aurélie Rieu
Nabil Aoudia
Centre de Recherche INSERM de Dijon
Département Mort cellulaire et Cancer
Food Biotechnology Instituto de
Agroquímica y Tecnología de
Alimentos-CSIC Valencia Spain
Carmen Garrido
Gaetan Jego
Johanna Chluba
Vicente Monedero García
et son équipe
Institut MICALIS UMR INRA-AgroParisTech
Equipe Bioadhésion, Biofilms et Hygiène des Matériaux
Romain Briandet
Julien Deschamps