Transcript 細菌の分子生物学
細菌の分子生物学 細菌の遺伝子 DNAジャイレースによるスーパーコイルの形成 DNAジャイレース ２本鎖切断 DNAジャイレース トポイソメラーゼⅣ スーパーコイル 染色体の複製 Ori 複製開始点（複製起点） 半保存的複製・・・二本鎖のそれぞれが鋳型になり，相補鎖が合成される DNA複製 半保存的複製・・・二本鎖のそれぞれが鋳型になり，相補鎖が合成される 3' 5' 5' 3' リーディング鎖 ラギング鎖 岡崎フラグメント 5' 3' 3' 5' ヘリカーゼ DNAポリメラーゼⅢ プライマーゼ DNAポリメラーゼⅠ RNA プライマー DNAポリメラーゼⅢ DNAリガーゼ ヘリカーゼ プライマーゼ 遺伝子発現 転写 DNA依存性RNAポリメラーゼ ホロ酵素 σ因子 DNA -35 コア酵素 aabb'w 転写（mRNA合成） パリンドローム配列による ヘアピン構造 → 転写終了 構造遺伝子 -10 +1 Shine-Dalgarno（SD）配列 転写開始点 リボソーム結合領域 TTGACA TATAAT Pribnowボックス（TATAボックス） プロモーター ターミネーター 翻訳（タンパク質合成） 遺伝暗号表(mRNAのコドン） ２文字目 U C A G U UUU Phe UUC Phe UUA Leu UUG Leu UCU Ser UCC Ser UCA Ser UCG Ser UAU Tyr UAC Tyr UAA オーカー UAG アンバー UGU Cys UGC Cys UGA オパール UGG Trp U C A G C CUU Leu CUC Leu CUA Leu CUG Leu CCU Pro CCC Pro CCA Pro CCG Pro CAU His CAC His CAA Gln CAG Gln CGU Arg CGC Arg CGA Arg CGG Arg U C A G A AUU Ile AUC Ile AUA Ile AUG Met ACU Thr ACC Thr ACA Thr ACG Thr AAU Asn AAC Asn AAA Lys AAG Lys AGU Ser AGC Ser AGA Arg AGG Arg U C A G G GUU Val GUC Val GUA Val GUG Val* GCU Ala GCC Ala GCA Ala GCG Ala GAU Asp GAC Asp GAA Glu GAG Glu GGU Gly GGC Gly GGA Gly GGG Gly U C A G １ 文 字 目 赤は停止コドン（終止コドン）。 * 原核生物では開始コドンとなる 縮重 ３ 文 字 目 翻訳の開始 NH2 N - O P O アミノアシルtRNA 合成酵素 O N O O NH2 N H2N CH COOH + ATP + tRNA - R O P O O N O tRNA 3'-末端 H2N CH CO O OH R H2N CH COO CH2 CH2 S CH3 tRNAfMet N OH O ホルミラーゼ 10-ホルミル テトラヒドロ葉酸 HCO NH CH COO CH2 CH2 S CH3 tRNAfMet N 代謝調節 ラクトースオペロンにおける転写調節 ラクトースオペロン プロモーター lacI Pi オペレーター lacZ Plac O1 mRNA O2 lacY lacA mRNA 結合 リプレッサー RNAポリメラーゼの オペレーターへの 結合を阻害 β－ガラクトシダーゼ ガラクトシド パーミアーゼ 誘導因子 （IPTGなど） ガラクトシド アセチルトランスフェラーゼ 染色体とプラスミド レプリコン 自律複製できるDNA分子・・・染色体，プラスミド プラスミド 細胞内において染色体とは独立に自律複製され， 細菌の生存にとって必須でないDNA分子 環状二本鎖，線状二本鎖，環状一本鎖 プラスミドの不和合性 ２種類以上のプラスミドが組合せによって共存できず， 一方が排除される性質 コリシンE1 アンピシリン耐性 テトラサイクリン耐性 AmpR TcR ori 6.6 kb 複製開始点 4.4 kb ori pBR322プラスミド ColE1プラスミド 大腸菌ゲノム： 4.6 Mb プラスミド F因子（Fプラスミド） 大腸菌の接合とDNA組換えに関与する コレラ菌：P因子，緑膿菌：PF因子 R因子（Rプラスミド） 薬剤耐性遺伝子を有する 接合伝達能をもつ（狭義のR因子） コリシン産生因子 大腸菌の抗菌性毒素タンパク質遺伝子を有する 抗菌性毒素タンパク質（バクテリオシン） 病原性プラスミド Entプラスミド（腸管毒素原性大腸菌ETECの毒素遺伝子を含む） Hlyプラスミド（溶血毒ヘモリシン遺伝子を含む） 薬剤耐性遺伝子群 組換え領域 IS3 IS1 tra IS3 100 kb 100 kb IS2 oriT IS1 ori oriV tra Fプラスミド oriT Rプラスミド DNA組換え（recombination） 二つの異なるDNA分子が会合し、交差が起こることにより新しいDNAの 組み合わせが生じること 相同的組換え（homologous recombination） DNAの相同領域間でおこる（細菌における普遍的組換え） 非相同的組換え（nonhomologous recombination） DNAの非相同領域間でおこる 細菌では稀，哺乳動物では一般的 転移因子による組換え DNA組換え 細菌の突然変異 DNA塩基の変化 塩基の置換（点突然変異 point mutation） Transition（転位） プリン→プリン，ピリミジン→ピリミジン A→G，G→A，T→C，C→T Transversion（転換） プリン→ピリミジン，ピリミジン→プリン A→T，A→C，G→T，G→C T→A，T→G，C→A，C→G 塩基の欠失（deletion） 塩基の挿入（insertion） 突然変異の型 ミスセンス変異 point mutation → アミノ酸残基の変化 TAC (Tyr) → TCC (Ser) ナンセンス変異 point mutation → コードが終止コドンに TAC (Tyr) → TAA (stop) 遺伝子のみの変異 → アミノ酸残基は変化しない TAC (Tyr) → TAT (Tyr) 復帰変異・・・変異した表現形質がもとの表現型に戻ること 真性復帰変異・・・変異した遺伝子が正常な状態に戻る サプレッサー変異・・・別の遺伝子が変異 → 変異形質の抑制 フレームシフト変異 deletion，insertionにより読み取り枠がずれる deletion ACC Thr CGT Arg GGT Gly ATC Ile TTC Phe ATA Ile ACC Thr ACC Thr CGT Arg GTA Val TCT Ser TCA Ser TAA Stop CCG G 細菌の主な変異現象 形態の変化 鞭毛，線毛，莢膜の消失 → 抗原性，病原性変化 集落の変化 S → R変異（平滑正円形 → 粗面不規則辺縁） グラム陰性菌 リポ多糖変異 R →S変異 炭疽菌，結核菌 H → O変異（クモリ形成 → 孤立集落形成） プロテウス属 鞭毛消失 H抗原（鞭毛抗原），O抗原（菌体表面抗原） 抗原性の変化 H抗原相変異 サルモネラ属 Vi → W変異 強毒サルモネラ（virulence抗原） 細菌の主な変異現象 毒力，病原性の変化 弱毒株 attenuated strain 無毒株 avirulent strain 人工培地で継代培養 → 病原性低下 耐性，抵抗性の変化 薬剤耐性化 ファージ，放射線，温度に対する感受性の変化 生化学的性状の変化 autotroph（原株）→auxotroph（栄養要求変異株） 変異原と変異原検出法 自然突然変異・・・細胞分裂１回につき10ｰ7～10ｰ11 誘発突然変異 ← 化学物質，放射線 変異原・・・突然変異を誘発する因子 物理的変異原 放射線（X線，γ線） DNA鎖切断 → 再構成 → 巨大損傷 紫外線 同一DNA鎖上のピリミジン残基の二量体化 O O CH3 CH3 HN O NH N N dR dR チミン二量体 O 化学的変異原 塩基類似体 ２－アミノプリン N N H2N Cl インターカレーター ICR-191 N H N N H NH OCH3 Cl アルキル化剤 ニトロソグアニジン 二本鎖DNAに挿入 フレームシフト変異 N NH H3C N NO その他のDNA修飾剤 ヒドロキシルアミン DNAへ取り込まれ トランジション変異 N H NH2OH NO2 プリンをアルキル化 トランジション トランスバージョン フレームシフト変異 シトシンをヒドロキシル化 トランジション変異 N N 2－アミノプリン N H N NH2 H N H N N N dR O CH3 N H N N O N dR N A O N H N N N dR N H O H T O N N H dR 互変異性 H H N G N dR N N H H O C H N N N N dR T H N CH3 dR N H N N N N H O dR C DNA損傷の修復 光回復 紫外線により生じるピリミジンダイマーの 青色光とデオキシリボピリミジンフォトリアーゼによる修復 ヌクレオチド除去修復 エンドヌクレアーゼとヘリカーゼによる損傷部分の切り出し DNAポリメラーゼとDNAリガーゼによる修復 組換え修復 損傷DNAの複製時に生じたギャップを相同DNA鎖で埋める SOS修復 DNA損傷 → recA遺伝子発現 → lexA遺伝子産物分解 → DNA修復遺伝子の転写活性化 SOS修復 SOS遺伝子群 recA lexA LexA蛋白 RecA蛋白 リプレッサー SOS遺伝子群 recA 変異原など lexA DNA修復酵素等の発現 活性化 RecA蛋白 プロテアーゼ DNA損傷の検出 Recアッセイ 枯草菌（Bacillus subtilis）のrec－株（DNA損傷高感受性）を利用して 化学物質のDNA損傷性を検出 Amesテスト ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）のヒスチジン要求株 を利用して変異原の復帰変異（his－ → his+）活性を検出 rya変異・･･・膜透過性が亢進する細胞膜変異 uvrB変異・･･除去修復能の欠失変異 プラスミド上の複製エラーを起こしやすいhisG遺伝子 遺伝子の伝達 細菌遺伝子の伝達 LederbergとTatumによる大腸菌の接合の発見（1947年） 接合（conjugation） 交配（mating）過程において，Fプラスミドの働きにより プラスミドまたは染色体遺伝子が別の菌に伝達される Fプラスミド 大環状プラスミド（100 kb） プラスミド移行に関わるtra遺伝子群（32 kb）を有する ２種類の複製過程 oriVにより遊離のプラスミド（１コピー）が複製 染色体に挿入され，染色体oriCにより複製 Fプラスミド 伝達に必要な遺伝子群 （～60遺伝子） oriT (origin of transfer) 伝達時の複製開始点 tra遺伝子群 32 kb IS（挿入配列）因子群 （転移に必要な配列） 100 kb プラスミド複製の開始点 oriV 相同組換えまたは転移によって稀に染色体に挿入される Fプラスミドの大腸菌染色体への挿入 E. coli染色体 挿入後，Fプラスミドはホストレプリコンの 一部として複製されoriV は抑制される Fプラスミド IS因子 挿入Fプラスミド oriV oriC Hfr菌 F+菌 挿入Fプラスミドを持つ 遊離Fプラスミドを持つ Frederick Griffithの実験（1928） 肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）の形質転換 注射 注射 S型菌 （病原性） 加熱 注射 混合 R型菌 （病原性なし） 注射 発病 発病せず 発病せず 発病 Oswald Averyの実験（1944） Griffithの形質転換因子がDNAであることを証明 マ ウ ス か ら 回 収 さ れ る 菌 形質転換（transformation） 外来のDNAが導入されたことによって細菌の形質が変化する現象 DNAが細胞に導入されて遺伝形質が変化すること コンピテント（competent） DNAを取り込みやすい状態 コンピテント細胞（適格細胞） 肺炎球菌 対数増殖期に自然にコンピテントになる インフルエンザ菌 特殊な富栄養培地中でコンピテントになる 大腸菌 低温で塩化カルシウム処理するとコンピテントになる 溶原性バクテリオファージの生活環 外被 ウイルス染色 ウイルス 体の侵入 染色体 ウイルス粒子 の放出 溶菌の環 （15～60分） 外被タンパク質の 合成とパッケージング ウイルス染色体 の増殖 溶原化 プロファージ 形質導入とファージ変換 形質導入（transduction） ファージ粒子によって宿主細胞のDNAが別の菌に運ばれ， その菌の染色体と組換えを起こすこと ファージ変換（phage conversion） ファージ遺伝子そのものの形質発現によって，細菌の 形質が変化すること。ファージ遺伝子は宿主染色体に 組み込まれている必要はない。 ファージDNA 完全ファージ粒子 供与染菌色体DNA片 細菌染色体 不完全ファージ粒子 供与菌DNA 溶原化 プロファージ 完全ファージ粒子 溶原菌 転移因子（transposable element） ゲノム上のある部位から別の部位へ 移動するDNA配列 挿入配列（insertion sequence，IS） 1 kb前後の小さな因子で，転移酵素トランスポゼースをはさんで 両末端に逆向きの反復配列（inverted repeat sequence，IR）をもつ トランスポゾン（transposon） 抗生物質耐性遺伝子などをはさむように両末端に挿入配列をもつ 非複製的（cut & paste）転移 TE TE + + Donor Recipient 複製的転移 解離 融合 TE TE + + TE Replicon A TE TE Relicon B TE: 転移因子 Cointegrate インテグロン インテグロン・・・抵抗性遺伝子などを集積する遺伝子構造ユニット インテグラーゼ ← ini遺伝子 遺伝子カセット内のattI 部位と標的部位（attC）の間の部位特異的 DNA組換えにより薬剤耐性遺伝子などをインテグロンに組み込む 細胞融合 細菌細胞A （ゲノムA） 細菌細胞B （ゲノムB） 細胞壁溶解酵素 プロトプラスト プロトプラスト ポリエチレン グリコール溶液 融合細胞 （ゲノムA＋ゲノムB） 細菌のゲノム構造 多様なゲノム ゲノム・・・一つの生物に含まれるすべての遺伝子の総体 読み枠（ORF）・・・転写・翻訳によりタンパク質に読み込まれる塩基配列 開始コドン～終止コドン アミノ酸数×3＋3の塩基数 真核生物ではエキソン（遺伝子部分）とイントロン（介在配列）がある 偽遺伝子 正しくタンパク質に転写・翻訳されないORF様配列 細菌のゲノムサイズ ゲノムサイズ（Mb） Homo sapiens（ヒト） Saccharomyces cerevisiae （出芽酵母） Bacillus subtilis （枯草菌） Borrelia burgdorferi B31（ライム病の病原スピロヘータ） Escherichia coli K12 MG1655（大腸菌） Haemophilus influenzae Rd（インフルエンザ菌） Helicobacter pylori 26695（ピロリ菌） Lactococcus lactis（乳酸菌） Mycobacterium tuberculosis H37Rv （結核菌） Mycoplasma genitalium (マイコプラズマ） Myxococcus xanthus（粘液細菌） Pseudomonas aeruginosa（緑膿菌） Streptomyces coelicolor（放線菌） Synecocystis sp.PCC6803 （ラン藻類） Treponema pallidum （梅毒トレポネーマ） Vibrio cholerae（コレラ菌） 3300 12 4.21 0.91 4.64 1.83 1.67 2.4 4.41 0.58 9.5 6.3 8.67 3.57 1.14 4 遺伝子数 20000~25000 6286 4100 850 4289 1709 1566 2266 3918 484 10000 5565 7825 3169 1031 3827 遺伝子の水平伝達 水平伝達・・・親から子孫への遺伝とは異なる，同世代間での遺伝子伝達 形質転換，ファージ変換，トランスポゾン，インテグロン 病原性遺伝子塊（PAI） 大腸菌の病原性関連遺伝子は染色体上の特定に位置に集中して存在する 溶血性毒素遺伝子，線毛形成遺伝子 ← 外来性 病原遺伝子の解析 病原性・・・微生物が宿主に感染して発病させる能力 侵入性・・・組織や細胞内への侵入 定着性・・・宿主の抵抗性に打ち勝って増殖 毒素産生性・・・宿主に有害な毒素（菌体外毒素）を生産 コレラ毒素，ボツリヌス毒素 腸管出血性大腸菌（Escherichia coli O157:H7） 病原遺伝子153個 肺炎クラミジア（Chlamydophila pneumoniae J138） 病原遺伝子38個