Transcript 電気泳動の基本・その1
前編：等電点電気泳動 電気泳動とは・・・ ある溶液に一対の電極を入れて直流電流を 流したとき、溶液中の荷電粒子が自分のもつ 電荷と反対の極に向かって移動する現象 1808年 ロシアの物理学者Reussが水中の粘土粒子で発見 1930年代 スウェーデンの化学者Tiseliusが電気泳動装置を考案 それを用いた多くの研究により1948年ノーベル化学賞受賞 電気泳動現象を利用して、電荷・ 分子量・形が異なる分子を分離・ 分析・分取することができる ゲルマトリックス中の分子の移動 － ＋ － ＋ － － ＋ ・プラス電荷分子は陰極へ ・マイナス電荷分子は陽極へ ・分子量が低いほど移動度が大きい ・同じ分子量でも形によって移動度 が異なる 分子ふるい効果 電気泳動の分類 A. 支持体 ・セルロースアセテート膜 ・ゲル アガロースゲル ポリアクリルアミドゲル ・ポリマー入り緩衝液 ・無担体 電気泳動の分類 B. 形態・方法 ・スラブゲル電気泳動 ・サブマリン電気泳動 ・パルスフィールド電気泳動 ・等電点電気泳動 ・キャピラリー電気泳動 ・フリーフロー電気泳動 二次元電気泳動（2D-PAGE） TWO-DIMENSIONAL POLYACRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS 一次元目：等電点の違いによる分離 二次元目：分子量の違いによる分離 異なった原理に基づいた2種類の電気泳動 を組み合わせることにより、一度に数千種類 ものタンパク質を分離することができる 二次元電気泳動の実験の流れ サンプル調整 一次元目の泳動（IEF) 二次元目の泳動（SDSｰPAGE) スポットの検出と泳動結果の解析 等電点電気泳動（IEF = Isoelectric Focusing） 等電点の差によってタンパク質を分離する （isoelectric point : pI) 両性分子の純電荷がゼロになるpH値 溶液のpHにより荷電状態が変化する分子 タンパク質は両性分子の性質を持つ タンパク質を構成するアミノ酸の残基は酸性溶液中では 正の電荷を持ち、塩基性溶液中では負の電荷を持つ － ＋ NH3 ＋ NH3 pH＜pI COO NH２ COO－ COOH NH3＋ － COO COOH NH3＋ pH＝pI COO－ NH２ pH＞pI 等電点では純電荷がゼロになる（＝電場の力を受けなくなる） ため、タンパク質の分子はその位置に留まる 等電点電気泳動のイメージ Before ＋ 8.8 3.9 7.1 7.1 8.8 8.4 7.1 3.9 3.7 5.3 3.7 5.3 － After ＋ 3.7 3.9 3.7 3.9 ｐHが低い 7.1 7.1 7.1 5.3 5.3 ｐH勾配 8.4 8.8 8.8 ｐHが高い － キャリアアンフォライトを用いたpH勾配 ポリアクリルアミドゲルにさまざまな等電点を持つキャリア アンフォライト（両性担体）混合物を加え電圧をかける ・製品のロット差が大きい ・pH勾配が不安定 ・チューブ状ゲルは壊れやすい 固定化pH勾配（IPG法： Immobilized pH gradient） ポリアクリルアミドゲル作製時に酸性や塩基性の種々の アクリルアミド誘導体（Immobiline)を添加しpH勾配をゲル に共有結合させる ・ｐH勾配が固定化されている ため正確で安定している ・酸性度・塩基性度が高いタン パク質も分離できる ・ゲルの取り扱いが簡単 Immobilineゲルの構造 （R＝弱酸性あるいは弱塩基性緩衝基） 再現性が高い２D-PAGEが 可能になった 各種サケ科の泳動パターン PhastGel IEF 5-8使用 CBB染色 lane 1,2：Atlantic salmon lane 3,4：Pink salmon lane 5,6：Chum salmon lane 7,8：Rainbow trout