Transcript 電気泳動の基本・その1
後編：SDS-PAGE 電気泳動前 7.1 8.8 3.9 7.1 等電点電気泳動 3.7 3.9 3.7 3.9 8.8 3.9 7.1 3.7 5.3 5.3 5.3 5.3 3.7 8.4 7.1 7.1 7.1 8.4 8.8 8.8 大 3.7 8.8 SDS-PAGE 3.9 5.3 7.1 分子量 8.8 7.1 3.7 3.9 5.3 7.1 8.4 小 SDS-PAGE：SDS-polyacrylamido gel electrophoresis SDS-ポリアクリルアミド電気泳動 還元剤を用いてジスルフィド結合（S-S結合）を切断したタンパク質に SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を加えるとSDS-タンパク質複合体が 生成される。これをポリアクリルアミドの分子ふるい効果を用いて分 子量に応じて分離する。 DTT SDS native-PAGE＝還元剤やSDSを用いずに行うPAGE ・ 分子量に応じた分離はできない ・ 泳動後に酵素活性やリガンドとの結合活性を調べることができる ポリアクリルアミドゲルの架橋構造 H2C CH CH2 CO CH (CH2 CH)n NH2 アクリルアミド ＋ CH2 CH CH)n CH2 CH (CH2 CH)n NH NH2 NH2 NH CH2 CO CH2 (CH2 CO NH N,N`ビスアクリルアミド NH2 CO CH2 H2C CH CH2 CO CO CO CO CH)n CO H H2C C NH (CH2 NH 重合 TEMED APS C CH H2 CO CH (CH2 CH)n CH2 CH (CH2 CH)n CH2 CH2 CO CO CO NH2 NH NH2 CH2 ポリアクリルアミドゲル ゲル濃度と分子量 アクリルアミドとN,N`ビスアクリルアミド（Bis）の質量の合計％濃度＝％T アクリルアミドとBisの総和に対するBisの割合＝％C （％Cが一定の場合） ％Tが高くなるほど低分子の分離が良くなり ％Tが低くなるほど高分子の分離が良くなる ゲル濃度 105 ポリアクリルアミドゲル濃度（％） 分離に適したタンパク質の分子量範囲（kD） 均一％ゲル 10% 分 子 量 104 ～ ～ 0 15% グラジエントゲル 5～15 5～20 10～20 20% 50 相対移動度（％） 5 7.5 10 12.5 15 100 36～200 24～200 14～200 14～100 14～60 14～200 10～200 10～150 ゲル濃度（％T）と分離能 5％ｹﾞﾙ 15％ｹﾞﾙ 4～15％ｹﾞﾙ 250 100 20 250 150 100 75 50 37 15 25 10 20 250 60 37 160 25 100 75 15 10 ※図中の数値の単位はkDa 分子ふるい効果とは・・・ 網の目状の支持体 （ポリアクリルアミド） ・電荷が大きい ・網の目を通りやすい形 ・分子量が小さい 分子の移動度が大きい タンパク分子の電荷と形を一定にすれば分子量に応じた分離ができる SDSの構造 H2 H2 H2 H2 H2 H3C C C C C C CH3C C C C C H2 H2 H2 H2 H2 疎水基 Oー O S O O ＋ Na 親水基 SDS（ドデシル硫酸ナトリウム：sodium dodecyl sulfate） ＝陰イオン系界面活性剤 ・タンパク質と結合し負の電荷を与える ・タンパク質の可溶化を促進する タンパク質立体構造の変化 １ ２ ３ ー ー ー ー ー ー 還元処理 （ ） DTT SDS処理 （ ー ー ） SDS ー ー ー ー ー S-S結合 ①タンパク質はジスルフィド結合で強固な立体構造をもっている ②DTTなどの還元剤の働きでジスルフィド結合が切断される ③タンパク質の疎水性部分にSDSの疎水基が結合し、鎖状のSDSタンパク質複合体を形成する タンパク質本来の電荷にかかわらず大きな負の電荷をもつ ー SDS-PAGEにおいてSDS-タンパク質複合体が分子量によって分離される理由 タンパク質1gに対しSDS約1.4gが結合 ⇒分子量5万のタンパク質では1分子あたりSDS約300分子に相当 タンパク質の総電荷は分子量5万の場合＋50～－50（pH8のとき） ドデシル硫酸基は－1の電荷をもっているので－300の電荷が与えられる SDS-タンパク質複合体の電荷は－250～－350となる SDSと結合したタンパクは・・・ ・分子の形は一定（直鎖状） ・ほぼ同程度の分子量／電荷比をもつ 移動度は分子量にのみ 依存する SDS-PAGEの模式図 ウェル ー 上部泳動用緩衝液： Tris-Glycine-SDS(pH8.3） 濃縮ゲル： Tris-HCl（pH6.8）,SDS 分離ゲル： Tris-HCl（pH8.8）,SDS 下部泳動用緩衝液： Tris-Glycine-SDS(pH8.3） ＋ Laemmli法の溶液系 濃縮ゲルおよび分離ゲル中での陰イオンの動き 濃縮される 濃縮ゲル中の陰イオンの配置 + 塩素イオン BPB SDS グリシン タンパク質 ー 濃縮ゲル中の移動速度：塩素イオン＞タンパク質＞グリシン ⇒それぞれのゾーンの境界で一時的に電圧が大きくなるためタンパク質は濃縮される 分離される 分離ゲル中の陰イオンの配置 + 塩素イオン BPB SDS グリシン タンパク質 分離ゲル中の移動速度：塩素イオン＞グリシン＞タンパク質 ⇒グリシンがタンパク質を追い越すとタンパク質は分子量の違いで分離される ー 大腸菌タンパク質の2D-PAGE pHレンジ 3-10 4-7 サンプル 40μg 80μg 5.0-6.0 120μg