Transcript TESE-ICSI POSTUPAK NA*A ISKUSTVA

TESE-ICSI
POSTUPAK
NAŠA ISKUSTVA
Sanja Vujisić Živković, Daria Hafner,
Mladen Stojčić
KB “Sveti Duh”, Zagreb
Čimbenici koji utječu na plodnost muškarca
•
•
•
•
•
Hormonski status
Genitalne infekcije
Kromosomske aberacije
Promjene na genskoj razini
Kemijski i fizikalni čimbenici
• Dijagnoza AZOOSPERMIA: odsustvo spermija u
ejakulatu i nakon centrifugiranja
• Azospermija pogađa 1 – 3 % populacije
• Od ukupnog broja muškaraca koji traže evaluaciju
plodnosti, u 10% slučajeva utvrdi se odsustvo
spermija
• Analiza kvalitete sjemena:
o Dva puta u razmaku od najmanje dva mjeseca
o U slučaju azoospermiae obavezno centrifugiranje uzorka i pregledavanje
talog (u 35% slučajeva nađu se spermiji dostatni za postupak ICSI)
o Biokemijska analiza sjemene tekućine: fruktoza, kisela fosfataza, citratna
kiselina, cink, LDH-X
• Mikrobiološka analiza ejakulata i urina
o Opstrukcija izvodnih kanala
o Urogenitalne infekcije dovode do porasta koncentracije protuupalnih
citokina u sjemenoj tekućini. Kao posljedica, javljaju se slobodni radikali.
Povećana koncentracija slobodnih radikala uzrokuje smanjenje
koncentracije nezasićenih i porast zasićenih masnih kiselina, što izravno
utječe na promjene propusnosti membrane spermija.
Analiza hormona:
- FSH (< 12IU/L) stimulira Sertolijeve stanice koje utječu na spermatogenezu
- Inhibin B (ref. 300pg/ml; > 80pg/ml) se stvara u Sertolijevim stanicama kao odgovor na
stimulaciju FSH, koncentracija je inverzna koncentraciji FSH
- LH , testosteron, hormoni štitnjače
Primarni hipogonadizam hipergonadotropni hipogonadizam :
- niskom razinom testosterona u
serumu i visokim koncentracijama
FSH i LH .
- izazvan je nepravilnostima u tkivu
testisa, čiji uzrok mogu biti:
kongenitalni anorhidizam,
kriptorhizam, zaušnjaci, genetske
nepravilnosti (Klinefelter-ov
sindrom, nepravilnosti androgenih
receptora i enzima), sindrom samo
Sertoli-evih stanica (engl. Sertoli cell
only), autoimuni sindromi (antiLeydig stanična nepravilnost)
testikularna trauma, tumori,
infekcije, kemoterapija, radijacija ili
ovisnost o alkoholu
Sekundarni hipogonadizam
hipogonadotropni hipogonadizam:
-niska ili niskom-normalnom
razinom FSH i LH, niska razina
testosterona.
- izazvan je nepravilnostima u
radu hipotalamusa ili hipofize što
za posljedicu ima nedostatnu
stimulaciju Leydig-ovih stanica.
- uzroci mogu biti različiti
uključujući: Kallmann-ov sindrom,
Prader-Willi sindrom, tumore i
lezije hipotalamusa i hipofize,
hiperprolaktinemiom, radijacija,
različite terapije ljekovima
- sekundarnim hipogonadizmom bolja prognoza: hormonskom
stimulacijom se može potaknuti
tkivo testisa.
Citogenetska i genetska analiza
Citogenetska analiza
- učestalost kromosomskih nepravilnosti
kod azospermije 17,3% od čega 7-13% na
konstituciju 47,XXY (Klinefelter-ov sindrom)
- aneuploidije spolnog kromosoma vezane su
za promjene u produkciji gameta (Klinefleterov sindorm; 45,X/46,XY gonadalna
disgeneza).
-promjene na razini zametnih stanica:
strukturne preraspodjele (translokacija,
inverzija i delecija) koje se zadržavaju tijekom
spermatogeneze kroz mitotičke i mejotičke
diobe do stadija zrelog spermija
- pacijent s normalnim brojem i strukturom
somatskih kromosoma može pokazati
različite nepravilnosti na svakoj stepenici
mejoze zametnih stanica.
Genske analize:
-genetski poremećaji i do 25% azospermija
-geni za faktor azospermije (AZF) (dugom
kraku Y kromosoma): AZFa, AZFb, AZFc i
AZFd. Delecija na proksimalnom dijelu
(AZFa i AZFb) - poremećaje u
spermatogenezi,; delecije AZFc i AZFd
regije mogu imati rezidualnu
spermatogenezu.
-kongenitalna bilateralno odsustvo vas
deferensa (CBAVD) javlja se u 1-2%
slučajeva , većina CBAVD ima mutaciju za
cističnu fibrozu (CFTR engl. cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator) s
povećanim rizikom varijante 5T.
-Kallmann-ov sindrom mogu uzrokovati
muacije vezane za X kromosom, a
posljedica je izostanak sinteze GnRH koja
uzrokuje hipogonadotropni hipogonadizam.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2006 Feb 1;124(2):197-203. Epub 2005 Sep 12.
Cytogenetic analysis of azoospermic patients: karyotype comparison of peripheral blood
lymphocytes and testicular tissue.
Stipoljev F, Vujisić S, Parazajder J, Hafner D, Jezek D, Sertić J.
Source
Clinical Cytogenetic Laboratory, Department of Obstetrics and Gynecology, Medical
School, University of Zagreb, Sveti Duh Hospital, Sveti Duh 64, 10000 Zagreb, Croatia.
[email protected]
Abstract
OBJECTIVE:
The objective was to compare the results of a complete chromosomal, genetic and
histological investigation in 13 azoospermic men with the results of the intracytoplasmic
sperm injection (ICSI) procedure.
STUDY DESIGN:
Peripheral blood samples were used for the measurement of follicle-stimulating hormone
(FSH) levels, chromosomal analysis, microdeletions in the azoospermia factor (AZF) region
of the Y chromosome and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)
mutation analysis. Testicular tissue was used for histological scoring and cytogenetic
evaluation.
RESULTS:
Peripheral blood cytogenetic analysis revealed a normal male karyotype in all cases.
Chromosomal analysis from testicular tissue revealed a mosaicism for the terminal
deletion of chromosome 22 with a breakpoint site at 22q13 in one patient with congenital
bilateral absence of the vas deferens (CBAVD). Deletions in the AZFa, ATFb, and AZFc
regions were not detected. The CFTR mutational analysis showed normal results in all
patients.
CONCLUSIONS:
Cytogenetic evaluation of testicular tissue should be performed in non-obstructive and
obstructive azoospermic patients as well as in patients with multiple failed IVF and
recurrent spontaneous abortion.
Urološki pregled i mišljenje
o Anamneza (stil života, preboljene bolesti, kronične bolesti, lijekovi,..)
o Klinički pregled (palpatorni i UZV – ESHRE guidelinses): kriptorhizam, proširene
vene u testisima, kongenitalne malformacije (izostanak vas deferensa), tumor,
trauma ....
o Nalaz hormona, analize kvalitete sjemena, mikrobiološke analize, citogenetske
i genetske obrade
o Terapijski postupci: operativna rekonstrukcija (EVS, orchidopexiam, op.
varicocela), hormonska terapija
• Opstruktivna azospermija:
o Spermatogeneza očuvana
o Blokiran transport spermija izvodnim kanalom
• Ne-opstruktivna azospermija
o Problem : na razini testisa, na predtestikularnoj razini
o U 50% slučajeva prisutni lokusi spermatogeneze u testisima
o Nema za sada testa koji sa sigurnošću može predvidjeti uspješnost postupka
dobivanja pozitivnog nalaza
Retrospektivni prikaz
• razdoblje od 10.2009. – 04.2012.
o kriopohrana tkiva testisa
• broj parova: 22
• broj postupaka: 40
n=13: opstruktivna
azospermija
(trauma, upalni
proces)
n=2: status post op
retrogradna ejakulacija
(+diabetes melitus i
insufficientio ren; st post
op ca recti)
n=3: status post EVS
(+ atrophio testis, FSH
21IU/L;
+ agenesio renis dex.;
+diabetes mellitus)
PACIJENTI
DOB: 28 -50 (37,3)
n=1: status post
hernioplasticam,
atrophio testis , FSH
18 IU/L
n=1: erektilna
disfunkcija
n=2: orhydopexiam
(+heterozigot na
cističnu fibrozu;
+ varricocole)
Pacijentice
• Dob 25 – 43 (33)
• Stimulacijski protokol
o 22 agonisti / HP-HMG ili rFSH
o 3 klomifen / HP-HMG ili rFSH
o 6 HP-HMG ili rFSH
o 9 HP-HMG ili rFSH/antagonisti
UROLOŠKA SALA
-
ZAHVAT SE ODVIJA U LOKALNOJ ANESTEZIJI
-
(infiltracija sjemene vrpce 2% Xylocain-om)
OTVORENA OPERACIJA NA TESTISU
-
(medijalna incizija → avaskularna regija → zarezivanje tunicae albugineae →
testikularni parenhim)
-
UZIMANJE TKIVA S DVA MJESTA cca 5 mm3
-
UZORAK U STERILNU POSUDU S FIZIOLOŠKOM OTOPINOM
-
DOSTAVLJA SE U LABORATORIJ
TELEFONOM SE JAVLJA NALAZ, UKOLIKO JE POTREBNO IDE SE
NA DRUGI TESTIS
LABORATORIJ ZA HUMANU REPORDUKCIJU
- identifikacija uzorka
- obrada uzorka
-tkivo testisa se stavlja u Petrijevu
posudu sa Sperm Wash medijem
(SAGE)
- na grijanoj plohi lupe, tkivo se
pomoću igala G21 reže na promjer
1 mm3
- dva do tri komadića se maceriraju
- preostalio tkivo se prebacuje u
četverozdenačne Nunc posudu sa
SpermWash medijem
- na grijanoj plohi inverznog
mikroskopa tkivo se analizira
POZITIVAN NALAZ BIOPSIJE TESTISA
PRIPREMA ZA POSTUPAK ICSI
-macerirano tkivo se ispire
centrifugiranjem 2x300g
- talog se nasloji hranilištem za
fertilizaciju (Ferilization Medium,
SAGE)
- nakon dva sata supernatant se još
jednom centrifugira, a talog se
stavlja u pripremljene kapi
- talog nakon centrifugiranja se
stavlja u pripremljene kapi
KRIOPOHRANA TKIVA
-tkivo se nakon ispiranja u mediju
Serm Wash , provlači kroz medij
za kriopohranu (Sperm Freezing
Medium SAGE)
-pripremljeni uzorci se stavljaju u
krioampule i kontrolirano im se
snižava temperatura -2C/min do
temperature od -30C
- pohranjuju se u spremnik za
tekući dušik
-KADA JE POTVRĐENO DA U UZORKU TIKIVA TESTISA IMA SPERMIJA,
PRISTUPA SE PUNKCIJI I ASPIRACIJI FOLIKULA
- DVA SATA NAKON PUNKCIJE FOLIKULA OOCITE SE PRIPREMAJU ZA
POSTUPAK ICSI
medij s tobrađenim
kivom testisa
7% PVP
medij s
oocitom
REZULTATI
• fertilizacija jajnih stanica: 87%
• 14 trudnoća
o 10 u svježim postupcima TESE-ICSI
o 3 nakon odmrzavanja tkiva testisa
o 1 nakon krio ET (blizanačka trudnoća)
• 2 spontana pobačaja
• 3 biokemijske trudnoće
• kumulativno: 9 poroda / 22 bračna para)
(40,9%)
Prikaz dvije pacijentice
• I slučaj: 6 ET 3 trudnoće, jedna
biokemijska, jedna rani spontani
pobačaj, nakon obrade dokazana
trombofilija , treća trudnoća donešena
uz terapiju niskomolekularnim
heparinom
• II slučaj: 4 ET dvije trudnoće, jedna
biokemijska, jedan rani spontani
pobačaj
Uspješnost: literaturni podaci
Esteves SC, Miyaoka R, Agarwal A. Sperm Retrieval Techniques for
Assisted Reproduction. International Braz J urol 2011. 37 (5):570-83
• Uspješnost TESE/ICSI postupka u parova s
diagnozomom opstruktivne azospermije
o Dobivanje spermija u 90 - 100%
o Uspješnost u dobivanju spermija ne ovisi o uzroku opstrukcije
o Nema razlike u uspješnosti postupka sa svježeg ili tkivom nakon
odmrzavanja
o Feritilizacija ICSI postupkom 45 – 75%
o Uspješnost ostvarenih trudnoća 26-57%
o Živorođene djece 18-55%
o Uspješnost ishoda postupka determinirana s dobi žene
• Uspješnost TESE/ICSI postupka u parova s diagnozom
ne-opstruktivne azospermije
o Dobivanje spermija 49,5%
o Ukoliko je prethodni histopatološki nalaz ukazivao na hipospermatogenezu,
izolirani su spermiji u 85% slučajeva
o Ukoliko je histopatološki nalaz bio neadekvatan, spermiji su izolirani u 6-25%
slučajeva
o Pokazalo se da FSH nije prediktivni čimbenik
o Kod djelomične ili ukupne delecije AZFc u 70% slučajeva izolirani spermiji, za
razliku od oštećenja regije AZFa ili AZFb
o U slučaju sindroma Klinefelter u 50% slučajeva izolirani spermiji, dok je uspješnost
ostvarenih trudnoća 30% do 50%, a rođena djeca imaju uredan kariotip.
Rezultati su bili bolji u slučaju kada su pacijenti prošli terapiju medikamentima
o Kod varicocele, pokazano je ukoliko je ona tretirana, u 53% slučajeva je nalaz
bio pozitivan za razliku od 30% u pacijenata s netretiranom varcocelom
o Uspješnost postupka (fertilizacija, ostvarene trudnoće) je bila bolja u svježem
postupku
Da li je povećan rizik malformacija u djece
začete TESE/ICSI postupkom
• Feddor i sur. (ESHRE 2007)
o Analiza rođene djece u Danskoj i Norveškoj (ukupno 412)
o Nije prisutna veća učestalost malformacija u djece rođene nakon
TESE/ICSI postupku u poredbi s djecom začetom u postupku IVF ili nakon
spontanog zanošenja.
o Uočen je porast hipospadije.
Woldringh GH, Besselink DE, Tillema AHJ , Hendriks JCM , Kremer
JAM. Karyotyping, congenital anomalies and follow-up of children
after intracytoplasmic sperm injection with non-ejaculated sperm: a
systematic review. Hum Reprod Update 2010; 16 (1): 12-19
•
•
•
•
•
Literaturni pregled s ciljem istražiti da li postoji potreba zabrinutosti glede ICSI postupka sa
spermijima dobivenim kirurškim putem
U obzir je uzet kariotip ploda,malformacije, praćenje djece
Rezultati su pokazali da je u literaturi prisutno 8 relevantnih studija, dvije navode kariotip, 5
malformacije, 1 navodi praćenje djece
Veće malformacije:
o 543 od 12 377 (4.4%) u postupku ICSI sa spermijima iz ejakulata
o 17 od 533 (3.2%) u PESE/ICSI postupku
o 31 od 670 (4.6%) TESE/ICSI
Nepravilni kariotip:
o 55 od 1973 (2.8%) u postupcima ICSI sa spermijima iz ejakulata
o 0 od 31 u slučaju PESE/ ICSI
o 5 od 191 (2.6%) u postupku TESE/ ICSI
ZAKLJUČAK: Iako nema statistički značajne razlike, autori smatraju da su navedene
grupe male i heterogene, te preporučuju standardiziranu metodologiju u „follow-up”
studijama nakon MPO.
CONCLUSIONS: Although there were no statistical differences, the study groups were
small and heterogenic, with a number of potential biases. We therefore recommend a
standardized methodology of follow-up studies after ART, with well-defined groups of
ICSI with ejaculated sperm, ICSI with epididymal sperm and ICSI with testicular sperm,
and a control group of naturally conceived children.
Belva F, De Schrijver F, Tournaye H, Liebaers I, Devroey P, Haentjens P,
Bonduelle M. Neonatal outcome of 724 children born after ICSI using
non-ejaculated sperm. Hum Reprod. 2011 Jul;26(7):1752-8.
Center for Medical Genetics, UZ Brussel, Belgium
• 530 djece rođene u postupku TESE/ICSI i 194 djece rođene u
postupku PESE/ICSI
• 2516 djece rođene u postupku ICSI sa spermijima iz ejakulata
• ZAKLJUČAK: dobiveni rezultati ohrabruju, djeca rođena u
postupcima sa spermijima dobivenim kirurškim putem po
praćenim parametrima se ne razlikuju od djece rođene u
postupku ICSI sa spermijima iz ejakulata.
• Conclusion: Overall neonatal health in terms of birth
parameters, major anomalies and chromosomal aberrations in
our large cohort of children born by the use of non-ejaculated
sperm seems reassuring in comparison to the outcome of
children born after the use of ejaculated sperm.
HVALA