Transcript Slajd 1

Równowagi chemiczne
TEORIA BRØNSTEDA i LAWRY’EGO
Teoria powstała w 1923 roku.
kwasem Brønsteda, HA, jest donor protonu
HA ↔ A- + H+
HA+ ↔ A + H+, HA2+ ↔ A+ + H+ …
HA- ↔ A2- + H+, HA2- ↔ A3- + H+ …
zasadą Brønsteda, B, jest akceptor protonu
B + H+ ↔ BH+
B+ + H+ ↔ BH2+, B2+ + H+ ↔ BH3+
B- + H+ ↔ BH, B2- + H+ ↔ BH-
TEORIA BRØNSTEDA i LAWRY’EGO
HA + H2O ↔ A- + H3O+
Kwas 1
Zasada 2
Zasada 1
Kwas 2
BH + H2O ↔ BH+ + OHZasada 1
Kwas 2
Kwas 1
Zasada 2
ROZPUSZCZALNIKI
Protyczne
H2O
CH3OH, C2H5OH
i-propanol
Gliceryna
CH3COOH
TFA
TCL
Aprotyczne
CHCl3
THF
CH2Cl2
DMF
DMSO
Heksan
Benzen
DYSOCJACJA WODY, SKALA pH
H2O(c) + H2O(c) ↔ H3O+(aq) + OH-(aq)
K w  aH O   aOH  c H O   c OH  1,0 10
3
14
3
pK w  14,00  pH  pOH
pH  pK w  pOH  14 - pOH
pOH  pK w  pH  14 - pH
INDYKATORY pH
(fenoloftaleina)
pH
INDYKATORY pH
(oranż metylowy)
RÓWNANIE HENDERSONA-HASSELBALCHA
 [A ] 

pH  pK a  log 
 [HA] 

 [BH  ] 

pOH  pK b  log 
 [B] 
Miareczkowanie mocnego
kwasu mocną zasadą
Miareczkowanie mocnego
kwasu mocną zasadą
+
Miareczkowanie słabego
kwasu mocną zasadą
Miareczkowanie mocnej
zasady mocnym kwasem
+
Miareczkowanie słabej
zasady mocnym kwasem
Miareczkowanie słabej
zasady słabym kwasem
Miareczkowanie kwasów o różnej mocy
mocną zasadą (porównanie)
Miareczkowanie kwasów o różnej mocy
mocną zasadą (porównanie)
Miareczkowanie mocnego kwasu o różnym
stężeniu mocną zasadą (porównanie)
Bufory używane w badaniach biologicznych
(wybrane)
Bufory używane w badaniach biologicznych
(wybrane)
H+
MES
O
NH+
O
N
SO3-
SO3-
OH-
HO
HO
H+
N
NH+
N
N
HEPES
SO3-
SO3-
OH-
HO
HO
H+
HO
HO
HO
TRIS
NH2
OH-
HO
NH3+
pH - metry
pH – metry – charakterystyka elektrody
pH – metry - kalibracja
Wartości pKa grup funkcyjnych aminokwasów
o właściwościach kwasowo-zasadowych
(białka)
-karboksyl (C-końcowa
grupa peptydów oraz białek)
~2.8 - 4.0
Asp, Glu
(wewnątrzłańcuchowe grupy
karboksylowe)
~3.3 – 5.0
His (imidazol)
~6.0 - 7.4
Cys (tiol, SH)
~8.5 - 9.2
Tyr (fenylowy OH)
~9.5 - 10.5
-aminowa (N-początkowa
grupa aminowa)
~8.0 - 9.9
Lys (-amino)
~9.8 - 10.4
Arg (guanidynowa)
~12.0 - 12.8
Glicyna (Gly)
H2A+
HA
A-
pKa1 = 2,3
pKa2 = 9,6
logβHA = 9,6
logβH2A = 11,9
Glicyna (Gly)
1.0
HA
0.8
Ulamek molowy
Punkt izelektryczny
H2A+
A-
0.6
pKa1
pKa2
0.4
0.2
0.0
2
4
6
8
pH
10
12
H3A2+
H2A+
HA
A-
Histydyna (His)
pKa1 = 1,8
pKa2 = 6,0
pKa3 = 9,2
logβHA = 9,2
logβH2A = 15,2
logβH3A = 17,0
Histydyna (His)
A-
H3A2+
Punkt izolektryczny
1.0
HA
H2A+
Ulamek molowy
0.8
0.6
pKa1
pKa2
pKa3
0.4
0.2
0.0
0
2
4
6
pH
8
10
12
Kwas glutaminowy
(Glu)
pKa1 = 2,1
pKa2 = 4.2
pKa3 = 9.6
logβHA = 9,9
logβH2A = 13,8
logβH3A = 15,9
Kwas glutaminowy (Glu)
H3A+
A2Punkt izoelektryczny
1.0
H2A
Ulamek molowy
0.8
HA-
0.6
pKa1
pKa3
pKa2
0.4
0.2
0.0
0
2
4
6
pH
8
10
12
Lizyna (Lys)
pKa1 = 2,1
pKa2 = 9,1
pKa3 = 10,8
logβHA = 10,8
logβH2A = 19,9
logβH3A = 22,0
Lizyna (Lys)
H3A2+
Punkt izoelektryczny
A1.0
HA
Ulamek molowy
0.8
H2A+
0.6
pKa1
pKa2
pKa3
0.4
0.2
0.0
0
2
4
6
pH
8
10
12
Punkt izoelektryczny (pI)
pI = pH izoelektryczne = punkt izoelektryczny = wartość pH,
przy którym sumaryczny ładunek molekuły o właściowościach
kwasowo-zasadowych wynosi ZERO.
Jeżeli pH < pI to sumaryczny ładunek molekuły jest dodatni
Jeżeli pH > pI to sumaryczny ładunek molekuły jest ujemny
+
0
-
Punkt izoelektryczny (pI)
Lys, Arg
Asp, Glu
Albumina ludzka (HSA)
(585 aa)
DAHKSEVAHR
LQQCPFEDHV
NCDKSLHTLF
CAKQEPERNE
DVMCTAFHDN
APELLFFAKR
KLDELRDEGK
FKAWAVARLS
VHTECCHGDL
ISSKLKECCE
DLPSLAADFV
LYEYARRHPD
CAAADPHECY
NCELFEQLGE
PTLVEVSRNL
DYLSVVLNQL
LVNRRPCFSA
ADICTLSEKE
KEQLKAVMDD
EGKKLVAASQ
FKDLGEENFK
KLVNEVTEFA
GDKLCTVATL
CFLQHKDDNP
EETFLKKYLY
YKAAFTECCQ
ASSAKQRLKC
QRFPKAEFAE
LECADDRADL
KPLLEKSHCI
ESKDVCKNYA
YSVVLLLRLA
AKVFDEFKPL
YKFQNALLVR
GKVGSKCCKH
CVLHEKTPVS
LEVDETYVPK
RQIKKQTALV
FAAFVEKCCK
AALGL
ALVLIAFAQY
KTCVADESAE
RETYGEMADC
NLPRLVRPEV
EIARRHPYFY
AADKAACLLP
ASLQKFGERA
VSKLVTDLTK
AKYICENQDS
AEVENDEMPA
EAKDVFLGMF
KTYETTLEKC
VEEPQNLIKQ
YTKKVPQVST
PEAKRMPCAE
DRVTKCCTES
EFNAETFTFH
ELVKHKPKAT
ADDKETCFAE
Punkt izoelektryczny
pI = 5,2
Histon ludzki H2A1
(130 aa)
MSGRGKQGGK
RAGLQFPVGR
AERVGAGAPV
AEILELAGNA
PRHLQLAIRN
VTIAQGGVLP
TESHHKAKGK
ARAKAKTRSS
VHRLLRKGNY
YLAAVLEYLT
ARDNKKTRII
DEELNKLLGK
NIQAVLLPKK
Punkt izoelektryczny
pI = 11,3
Chromatografia jonowymienna
(anionity i kationity)
Chromatografia jonowymienna
Chromatografia jonowymienna
Protein A – białko naładowane dodatnio
Protein B – białko naładowane ujemnie
Asocjacja in vivo,
oddziaływanie biomolekuł
Hormon, insulina odgrywa bardzo wiele funkcji w organizmach
regulując procesy fizjologiczne. Regulacja ta zachodzi poprzez
bezpośrednie oddziaływanie z innymi makromolekułami
(najczęściej receptorami zawartymi w błonie komórkowej),
wywołując kaskadę kolejnych procesów.
• w komórkach mięśniowych wywołuje wzrost metabolizmu
glukozy;
• w fibroblastach insulina działa jako czynnik wzrostu;
• w komórkach wątrobowych insulina aktywność enzymów
odpowiadających za syntezę glikogenu.
Asocjacja in vivo,
oddziaływanie biomolekuł
Palce cynkowe – regulujące
domeny białkowe,
Oddziaływujące z DNA, RNA
lipidami oraz innymi białkami
Oddziaływanie regulujące => proces odwracalny
(stała oddziaływania, asocjacji średnia lub umiarkowanie silna)
Oddziaływanie strukturyzujące => proces zazwyczaj
nieodwracalny
(stała oddziaływania, asocjacji bardzo silna)
Asocjacja in vivo,
oddziaływanie biomolekuł
Oddziaływanie
Kd (M)
Rozpoznawanie komórkakomórka
10-5-10-4
Przeciwciało/antygen
10-8
Cytokina/receptor
10-9
Enzym/inhibitor
(Trypsyna/BPTI)
10-13
Pomiary stałej asocjacji/dysocjacji przy
stałym pH
(stałe warunkowe, kondycyjne)
Stała asocjacji (wiązania, trwałości):
[AB]
A + B ↔ AB
Ka 
[A][B]
Stała dysocjacji:
[A][B]
AB ↔ A + B
Kd 
[AB]
Związek pomiędzy stałą asocjacji i dysocjacji:
1
1 1
1 
Kd 
Ka 
[M]
M 
Ka
K d  M

Wyższe powinowactwo, niższa wartość Kd
Miareczkowanie UV-Vis
Miareczkowanie UV-Vis
Miareczkowanie UV-Vis
(widma różnicowe)
Miareczkowanie UV-Vis
(widma różnicowe)
Miareczkowanie UV-Vis
(punkt izosbestyczny)
Spectrophotometric equilibrium binding titration of P450 3A4 with ketoconazole.
Isin E M , Guengerich F P J. Biol. Chem. 2007;282:68636874
©2007 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
Miareczkowanie CD
Miareczkowanie UV-Vis i CD
Pomiar szybkości reakcji, a jej postęp
Miareczkowanie ITC
Miareczkowanie NMR
Postęp reakcji asocjacji- stała dysocjacji
Postęp reakcji asocjacji- stała dysocjacji
Kompleks (a. u.)
Kd 
[A][B]
[AB]
B
(1)
 c B  AB
 AB max  AB (2)
Podstawien ie (2) do (1)
z przestawie niem :
[A], mM
[AB] 
lub

A Komplexmax
Kompleks 
A  K D
A  AB max
A   K D

AKompleksmax
Kompleks 
A  K D
14
14
12
12
10
10
Intensywnosc
Intensywnosc
Postęp reakcji asocjacji- stała dysocjacji
8
6
4
2
8
6
4
2
0
0
0
50
100
150
200
1
[A] [mM]
10
[A] [mM]
Kd = 43 mM = 4.3×10-5 M
100
Postęp reakcji asocjacji – równanie Hilla
14
12
Intensywnosc
10
8
6
4
2
0
3.5
4.0
4.5
-log[A]
5.0
5.5
6.0
(pA)
 xn 
 K an 
  d 2  n

y  d1  n
n 
n 
x K 
 x  Ka 
d1, d2 – intensywności dwóch
różnych stanów
n – współczynnik Hilla
Postęp reakcji asocjacji – równanie Hilla
n=4
n=3
14
n=2
12
Intensywnosc
10
8
6
4
n = 0,25
2
n = 0,5
n=1
0
3
4
5
pA
6
Iloczyn rozpuszczalności
57