Transcript Materiały uzupełniające do przygotowania sprawozdania

Instrumentalne Metody Badania Struktury i Aktywności
Biomolekuł
(IMBSiAB)
podsumowanie laboratorium
prof. M. Kamiński
GDAŃSK 2013
Cel ćwiczenia - zasadniczy
Poznanie w praktyce metodologii / metodyk
postępowania dla doboru optymalnego układu
rozdzielczego typu HPLC do rozdzielania
peptydów / białek i otrzymania frakcji w celu
dokonania, następnie, badań struktury
molekularnej , właściwości „użytkowych” itp.
na przykładzie rozdzielania składników supernatantu
hodowli bakteryjnej dla wydzielenia aktywnej formy
naturalnych antybiotyków peptydowych (bakteriocyn)
– „stafylokokcyn” - „St T”, lub St C”.
Cele dodatkowe
• Poznanie alternatywnych układów LC, umożliwiających osiągnięcie celu
zasadniczego – izolacji aktywnej formy naturalnego antybiotyku
peptydowego;
• Poznanie zasad i sposobów określania (wyznaczania / obliczania) oraz
doboru („projektowania”) optymalnych wartości „parametrów
operacyjnych” dla wybranych alternatywnych układów rozdzielczych,
potencjalnie umożliwiających osiągnięcie celu zasadniczego;
• Zespołowe rozwiązywanie problemów oraz zespołowa praca nad
przygotowaniem raportu z badań
• Poznanie „techniki” LC/HPLC i najważniejszych problemów, które mogą
mieć miejsce
Zasada realizacji ćwiczenia oraz
przygotowania sprawozdania – raportu z
badań
• Praca eksperymentalna w „podgrupach”
• Zespołowe opracowanie wyników przez podgrupy
przygotowanie części sprawozdania / raportu z badań podgrupy,
wraz z wynikami obliczeń najważniejszych parametrów
operacyjnych i wnioskami, wynikającymi z badań podgrupy
• Zespołowe opracowanie sprawozdania całej grupy oraz
opracowanie zależności / wniosków dodatkowych
tzn., „części spinającej” badania w podgrupach, ew. obliczenie /
wyznaczenie dodatkowych parametrów / zależności funkcyjnych
możliwych do określenia dopiero na podstawie badań
poszczególnych podgrup – łącznie oraz sformułowanie
dodatkowych wniosków
Etapy procedury, skala operacji, układy rozdzielcze, opis
warunków i parametry operacyjne rozdzielania
• Przygotowanie „wsadu” / „pre-rozdzielanie” / rozdzielanie „właściwe”
jedno-, najczęściej, wielo-etapowe z zastosowaniem detekcji - jeden, albo kilka
detektorów HPLC, połączonych szeregowo lub równolegle / kontrola czystości
frakcji (z zastosowaniem „analityki instrumentalnej , w tym, HPLC) / kontrola
aktywności antybiotycznej), // wydzielanie „produktu” / „doczyszczanie”
(poza ramami czasowymi ćwiczenia)
• Skala modelowa / powiększanie skali rozdzielania (poza ramami
czasowymi ćwiczenia)
• GPC / SEC – H (war. hydrofilowe) – rozdzielanie wstępne, odsalanie; RP /
HILIC // IExC / IExcl – (jedna z tych odmian chromatografii nieprzydatna dla peptydów i
białek – która ?)
• Parametry „operacyjne” - rodzaj sorbentu / powierzchnia sorpcyjna (A),
wielkość porów (d/ Δd), kształt i wielkość ziaren wypełnienia kolumn/y (dp / Δdp),
natężenie przepływu eluentu (w) / liniowa prędkość (u) / średnica (dc), długość
kolumny (Lc), stężenie roztworu dozowanego (Cmix) / objętość dozowana (Vi)
rozpuszczalnik roztworu dozowanego , korzystnie - w przeliczeniu na jednostkę masy
/ objętości / powierzchni wypełnienia kolumny // jednostkę przekroju
poprzecznego kolumny
Zasady powiększania skali rozdzielania w
kolumnowej elucyjnej chromatografii
(nie tylko cieczowej, ale także P-GC, P-SFC)
P
Produkcja
Dobór : dp, Lc, u/w, Ci, Vi, ptów kolekcji frakcji, czasu
cyklu rozdzielania // żądanej
czystości produktu (ów)
M (A)
M
GPC/SEC
RP / HIC
NP/ NP-w / HILIC
IEC (ew. IPC)
Przygotowane „wsadu” : fragmentacja /
suszenie rozdrabnianie, albo
homogenizacja, roztwarzanie, albo
ekstrakcja / ługowanie, filtracja /
dekantacja, wirowanie, NF / UF / MF, LE /
CC-LE / CCC / FFF / CC-LE i inne techniki
Rys. 1. Ilustracja dwuetapowego postępowania podczas powiększania skali procesu
rozdzielania w celu otrzymywania substancji metodami chromatografii w skali
preparatywnej lub procesowej. M-skala modelowa rozdzielania – dobór
optymalnych warunków operacji rozdzielania, P – skala preparatywna / procesowa
– realizacja rozdzielania w warunkach przeładowania kolumny
RID
Schemat ideowy detektora UV-VIS / DAD
Schemat budowy i
działania
różnicowego
detektora
refraktometrycznego
„TECHNIKA”
Przykłady otrzymanych przez Państwa wyników
rozdzielania, przebiegu chromatogramów, widm
UV-VIS / RID - do opracowania, sformułowania
wniosków w sprawozdaniach podgrup / grup
laboratoryjnych
PRE-rozdzielanie / odsalanie GPC/SEC – H kolumna HPLC – DIOL 100
RP-HPLC – elucja gradientowa, detekcja UV-VIS-DAD
Możliwość określenia widm / identyfikacji wstępnej na podstawie UV-VIS (proszę zwrócić
uwagę na : ewentualność wykluczania, wartość długości fali w maksimum widm, okoliczność
absorpcji światła UV przez St-T/St-C do 305 nm / ewentualność wytrącania się składników
mieszaniny dozowanej w momencie dozowania do kolumny, zakres zmienności wartości
molowych współczynników absorpcji światła składników.
Zestawienie chromatogramów różnych wsadów
Pik „32,96 min” – składniki o wysokiej hydrofobowości pozostałe w
kolumnie po elucji „St” , eluowane w warunkach zwrotnego
przepływu eluentu
Warunki RP - integrator, zbieranie frakcji; Stosowanie przepływu
zwrotnego eluentu w kolumnie; Kolejno - badanie czystości frakcji /
aktywności a-biotycznej ;
Zestawienie widm UV kilku peptydów
Nałożenie chromatogramów rozdzielania w tych samych warunkach RP , elucja izokratyczna
Warunki HILIC, elucja
izokratyczna
– należy preferować
elucję izokratyczną w
P-LC / P-HPLC, w
przypadku
rozdzielania peptydów
/ białek elucja
gradientowa może
zapewniać lepszą
selektywność
rozdzielania
Kolumna Accucore – HILIC – układ ortogonalny względem RP
Chromatogramy dla kilku różnych długości fali światła UV
Nałożenie chromatogramów – dwie różne bakteriocyny – St T i St C – HILIC warunki
izokratyczne
Oznaczenie czystości frakcji
Możliwość stosowania nowoczesnych technik chemii analitycznej, w tym
HPLC-UV-VIS/DAD; Identyfikacja na podstawie czqasu retencji, oraz
dodatkwo, z zastosowaniem widm UV-VIS dzięki detektorowi DAD;
Korzystne stosowanie układów „ortogonalnych” , np., rozdzielanie – RP /
oznaczanie czystości frakcji / produktu – HILIC lub NP..
Płytka #2
Badanie aktywności antybiotycznej
1
F VI 11,8-14,41
+++
2
F II 3,3-5
Brak
3
F I 2,15-3,3
+
4
F III 5,0-6,1
Brak
5
F IV 6,1-9,1
+/-
6
F V 9,1-11,8
++
7
F VIII BF 33,7-42,0
Brak
8
F VII 14,4-17,0
Brak
9
F 2 2,6-5,8
Brak
10
F 5 12,2-20,0
Brak
11
F 3 5,8-8,2
+/-
12
F 4 8,5-11,6
++
13
F 1 1,95-2,6
Brak
14
BF 37,0-45,0
Brak
15
5 1,86-4,44
Brak
16
8 7,52-8,46
Brak
17
1 0,49-0,77
Brak
18
2 0,87-1,74
++
19
6 4,45-4,64
Brak
20
7 4,65-7,50
Brak
wzrostu
Dodatkowe informacje
Staf T 16.04.13 ACN:H2O
3:7 + 0,075% TFA (HP1050)
Strefa
zahamowania
(intensywność +/-,+,++, +++)
Staf C 16.04.13
ACN:H2O 3:7
+0,075% TFA
(HP1050)
Frakcja
19.04.13
ACN:H2O, 2 część
frakcji gr. P.
Czerniejewska
Nr
krążka
Przykłady rezultatów badania
aktywności anty-biotycznej –
wartości zahamowania strefy
wzrostu kolonii bakteryjnej
U góry - widok płytki z rezultatami
badania aktywności a–biotycznej
frakcji;
Obok – zahamowanie sterfy
wzrostu kolonii bakteryjnej w
świetle przechodzącym
Problem braku
korekty
opóźnienia
transportowego
dla programu
elucji
- w przypadku
niniejszego
rozdzielania najpierw brak
„korekty”,
potem zbyt
„stromy”
program elucji