Transcript Kaminska-s10

SEMINARIUM W RAMACH PROJEKTU
„Kwantowe nanostruktury półprzewodnikowe
do zastosowań w biologii i medycynie - Rozwój
i komercjalizacja nowej generacji urządzeń
diagnostyki molekularnej opartych o nowe
polskie przyrządy półprzewodnikowe
Zadanie 19. Opracowanie podstaw budowy
sensora przeciwciał na bazie powierzchni GaN i
ZnO modyfikowanych peptydami.
15 listopad, 2011
Agnieszka Kaminska , Sylwester
Gawinkowski, Tomasz Rolinski,
Jacek Waluk, Robert Hołyst
Instytut
Chemii
Fizycznej
PAN
Antigen-Antibody interactions
Laser excitation
epitope
antibody
Sers platform
SERS spectrum – detects
specific antibody-antigen
binding event
*The epitope is small (~6 amino acids or ~6
sugars) or a small part of a larger antigen
I.
1.
Zadania wykonane
Opracowanie aktywnej platformy do badań powierzchniowo
wzmocnionej spektroskopii Ramana ( ang. Surface enhanced
Raman Spectroscopy, SERS) bazującej na GaN
(1) Opracowanie procedur trawienia GaN ( we współpracy z IWC, Janusz
Weyher,
Igor
Dzięcielewski)sprawdzenie
wpływu
takich
parametrów jak skład i proporcje roztworów używanych do
trawienia, czas trawienia, wpływ właściwości warstw GaN tj.
gęstości dyslokacji w celu otrzymania optymalnych podłoży do
badań ramanowskich
(a)
(b)
SEM images of sample 185-4 after (a) photo-etching and (b) additional etching in hot KOH solution
(a)
(b)
SEM images of samples N1516-3.1 and -IV.1 after (a) 5 minutes and (b) 10 minutes photo-etching
I.
1.

Zadania wykonane
Opracowanie aktywnej platformy do badań powierzchniowo
wzmocnionej spektroskopii Ramana ( ang. Surface enhanced
Raman Spectroscopy, SERS) bazującej na GaN
(2) Optymalizacja procedur pokrywania trawionych podłoży GaN
warstwami Au i stopem Au-Ag (60%/ 40%)
Au
400 nm
SEM images of samples (a) after photo-etching
and (b) subsequent evaporation of ~ 70 nm of Au.
Photo-etching of GaN was done in the K2S2O8-KOH
water solution under UV illumination
Au-Ag (60%/ 40%)
I.
Zadania wykonane
2. Fabrykacja nowych podlozy do pomiarów SERS bazujących na nanodrutach ZnO
pokrytych zlotem. z wykorzystaniem techniki CVD(Chemical Vapour Deposition) na
podłożu.
1.Aktywacja podłoża ITO przy zastosowaniu KMnO4
2.Reaktywny wzrost nanostruktur ZnO z roztworu zawierającego Zn(NO3)2 oraz KOH
3. Pokrycie warstwą złota
Rys.1. Widma SEM podlozy do pomiarow SERS otrzymanych technika
CVD. Zdjęcia dla próbek otrzymanych w warunkach T=800oC, t=15 min,
VNH3=1o dm3*h-1, VN2=140 dm3*h-1.
EF=104
I.
Zadania wykonane
Opracowanie metody do analizy powtarzalności widm Ramana bazującej na
korelacji liniowej Pearsona
Rys. Porównanie serii danych przed filtracją (górny
panel) i jej drugiej pochodnej uzyskanej za pomocą
filtra ( dolny panel).
Tabela1. Wartości współczynników korelacji
liniowej między drugimi pochodnymi
spektrogramów
I.
1.
Zadania wykonane
Opracowanie procedur kontrolowanej immobilizacji peptydów na
platformach sersowskich.
Immobilizacja aminokwasów na powierzchni sersowskiej pokrytej monowarstwą kwasu
11-merkaptoundekanowego (-), struktury nieuporządkowane, liczne wiązania
wodorowe
Immobilizacja aminokwasów na powierzchni sersowskiej pokrytej monowarstwą
cysteaminy – „ tworzenie wiązań peptydowych w wyniku reakcji EDC/NHS” - (+)
Zbadanie wpływu warunków otrzymywania monowarstw cysteaminy na strukturę
otrzymywanych warstw
wpływ pH
czasu adsorpcji
stężenia roztworu adsorpcyjnego
elektrolitów
Monowarstwy cysteaminy- podsumowanie
Optymalne parametry procesu samoorganizacji prowadzące do
monowarstw cysteaminy zbudowanych głównie z konformerów
Trans !!!
adsorpcja z rozpuszczalników polarnych
z roztworów o stężeniu powyżej 15mM
czas adsorpcji 1.5h
pH od 1.5 do 3
I.
1.
Zadania wykonane
Immobilizacja aminokwasów i peptydów na monowarstwach
łącznikowych
Optymalizacja warunków prowadzenia reakcji EDC/NHS ( wpływ pH, czasu,
stężeń i proporcji reagentów)
Immobilizowany peptyd musi mieć odpowiednią
zachowywać swoją aktywność biologiczną
orientację
i
2. Immobilizacja przeciwciał na zmodyfikowanych polipeptydami
platformach.
Optymalizacja warunków tworzenia kompleksu
kompleksu peptyd
blokujący-przeciwciało (pI przeciwciała, stosunek ilościowy
reagentów, pH buforu z przeciwciałem - pomiędzy pIAg a pIAb,
czas)
Immobilizacja aminokwasów
Widmo SERS (a)
monowarstwy cysteaminy
zaadsorbowanej na podlozu
GaN pokrytym zlotem;
widma SERS widmo SERS
monowartwy cysteaminy z
przylaczonym kwasem
glutaminowym po 10min i
( b; (c) 30 min. i (d) 2
godzinach modyfikacji
aminokwasem. Insert
przedstawia normalne
widmo Ramana kwasu
glutaminowego.
Antigen- Blocking peptide interaction
blocking peptide (Akt(pan)) + mAb
blocking peptide (Akt(pan))
I.
Zadania wykonane
1.
Rejestracja i opracowanie widm Rama 20 aminokwasów
2.
Rejestracja i opracowanie widm SERS aminokwasów
3.
Rejestracja i opracowanie widm hetero i homo-peptydów
Baza widm
Identyfikacja położenia pików aminokwasów względem
pików danego aminokwasu na przykładzie tyrozyny
I - intensywności pików tyrozyny
E - położenia pików tyrozyny
n - liczba pików pozostałych
aminokwasów mająca to samo położenie
Arg – położenie pików argininy zgodnych
z położeniem pików tyrozyny. Liczba
oznacza intensywność, zaś puste miejsce
– brak piku
Pro – Trp – jak wyżej dla odpowiedniego
aminokwasu
Identyfikacja aminokwasów w mieszaninie na podstawie spektrogramu
Rysunek. Uproszczony spektrogram mieszaniny tyrozyny i asparaginy do badania
korelacji ze spektrogramami pojedynczych aminokwasów. Piki czerwone (zielone) są
skorelowane z pikami w spektrogramie asparaginy (tyrozyny).
Tabela. Ilość par skorelowanych dla poszczególnych
aminokwasów. Piki na spektrogramie są sumą
mnogościową wszystkich par skorelowanych dla danego
aminokwasu.
II. PLANY
.

Modyfikacja platform sersowskich wybranymi peptydami blokującymi i analiza
zmian w widmach ramanowskich indukowanych tworzeniem się kompleksów
peptyd blokujacy (epitop) – przeciwciało
- kompletowanie bazy widm
ramanowskich

Zintegrowanie chipu polipeptydowego z układem mikroprzepływowym

Testowanie chipu polipeptydowego do wykrywania ważnych immunologicznie
przeciwciał jak: IgM, IgA, IgG, albuminy, transferyny, ceruloplazminy z
materiałów biologicznych ( surowica krwi, mocz) i kolejno optymalizacja chipu
na jedno wybrane przeciwciało

Opracowanie platform sersowskich bazujących na ZnO
SERS microfluidic sensor
Figure Schematic representation of an integrated SERS-CD platform for biomolecule detection.
(a) A SERS spectroscopy and a SERS-CD platform. (reservoirs for activating chemicals (A), cells (B),
media (C), and vent (D)) (b) Cell trapping schematics comparing cells before trapping (left) after trapping
(right). (C) Sample concentrating cycle: secreted molecules are delivered (left), absorbed (center) and
then accumulated on a SERS probe (right), which results in molecule concentrating.