Transcript Valgukiibid - Julia Mastitskaja e

Valgukiibid: mis need on ja
milleks kasutatakse?
STOM, 2. rühm
Joosep Laos, Alexey Nesterovich,
Aleksandra Stepanenko, Julia
Mastitskaja
Valgukiibid
• Suure tootlikusega meetod, mida kasutatakse valkude
vastastikmõju ja aktiivsuse jälgimiseks ning nende funktsiooni
uurimiseks suures ulatuses.
• Suur valkude arv saab olla jälgitud paralleelselt
• Kiip koosneb: tugipinnast (nagu alusklaas), nitrotselluloos
membraanist, helmest või mikrotiiterplaadist, mille küljes on
seotud valkude järjestus.
• Proovi molekulid on märgistatud fluorestseeruva värviga ning
lisatud reastusele
• Iga reakstsioon proovi ja fikseeritud valgu vahel kiirgab
fluorestsents värvi, mida loeb laser skanner
• Valgukiibid on kiired, automatiseeritud, ökonoomsed,
ülitundlikud
Reastuse loomine
• Valgud on reastatud kõvale aluspinnale nagu
mikroskoobi alusklaasid, membraanid, helmed
või mikrotiiterplaadid.
• Selline pind pakub tuge valkudele, mis hakkavad
sinna kinnituma.
• Valgud on natiivses konformatsioonis.
• Aluspind on kaetud kattega, mis kinnitab
proteiini, takistab selle denaturatsiooni,
võimaldab hüdrofiilse keskkonda, kus saab
tekkida reaktsioon
Reastuse loomise meetodid
1.
2.
3.
4.
Kõige levinum: robotid paigutavad proteiine või nende
ligandeid kaetud tahkele alusele ettemääratud
mustrisse.
Valkude polümeeride dispersioon tahkele alusele
soovitud mustrile.
Prindipea liigub mööda järjestust ja igas punktis
kasutatakse elektrilist stimulatsiooni proteiini
molekulide ülekandmiseks.
Fotolitograafia – valgust kasutatakse ühinemisel
fotomaskidega, läbipaistmatu aukudega plaadiga või
kilega, mis võimaldab valguse pääsemist mustrile.
Keemilised reaktsioonid võimaldavad proteiini
sadestumist soovitud mustrile, kuni materjal on
fotomaski all
Kiipide tüübid I
•
•
•
•
Analüütilised
Antikehad kinnitatakse pinnale
Lisatakse valgu lahus (nt lüüsunud rakkudega)
Saab määrata ekspressiooni, afiinsust,
aktiivsust
• Eriti hea ekspressiooni võrdlemiseks erinevate
lahuste puhul
Kiipide tüübid II
• Funktsionaalsed valgukiibid
• Kasutatakse puhtaid valke
• Uuritakse valk-valk, valk-DNA, valk-RNA, valkfosfolipiid vastastikmõju
• Samuti hindamaks ensüümide aktiivsust,
leidmaks antikehasid ja näidata nende
spetsiifilisust
Kiipide tüübid III
• Pöördfaasi valgukiibid
• Kasutatakse lüüsitud koeproovi
• Eksponeeritakse uuritavale valgule vastava
antikehaga
• tuvastatakse luminestsentsiga
• Prinditakse alusele, et määrata koguseid
• Saab tuvastada modifitseeritud valke
Rakendamine I
• Diagnoostika
- ak-ag detekteerimine
- seerumi töötlemine
- haiguse, keskkonna ja toidu jälgimine
• Proteoomika
- Proteiinide ekspresssioni määramine
• Antikeha iseloomustus
- risti-reaktiivsuse, spetsiifilisuse ja epitoopide
iseloomustamine
Rakendamine II
• Proteiinide funktsionaalne analüüs
- valk-valk ja valk-fosfolipiid interaktsiiooni, väikeste
molekulide sihtmärkide, ensümaatilist substraatide,
retseptoti liigandite identifitseerimine
• Ravi areng
- ag-spetsiifilise teraapia autoimmuunsuse, vähi ja
allergia vastu areng
- Väikeste molekulide sihtmärkide identifitseerimine
Meetodi kasutamise põhjus
• Valgukiibid võeti kasutusele DNA mikrokiipide piiratud võime tõttu
määrata geenide ekspressiooni taset proteoomikas.
• Eelkõige valgud, mitte mRNA, mängivad olulise rolli rakuvastuse
mehhanismis
• Posttranslatsioonilised muutused, mis tihti osutuvad peamisteks
faktorideks proteiinide finktsiooni määramisel, on nähtamatud DNA
mikrokiipide jaoks.
• Valgukiibid asendasid traditsioonilisi meetmeid nagu 2D geel
elekroforees ja kromatograafia, mis olid aegakulukad, liiga
keerulised ja sobimatud harvaesinevate proteiinide analüüsiks.
Takistused
•
•
•
•
•
•
•
Valgukiipide tootmine hõlmab rohkem etappe võrreldes DNA kiipide
tootmisega:
Sobiva pinna ja sidumismeetodi leidmine, mis võimaldab
proteiinidel säilitada nende sekundaarse ja tertsiaarse struktuuri
ning seega ka bioloogilise aktiivsuse.
Pika elueaga kiibi produktsioon selleks,et kiibil olevad valgud ei
denatureeriksid ära lühikese aja jooksul.
Identifitseerida ja isoleerida antikehasid
Siduva proteiini taseme määramine
Määratud proteiini ekstraheerimine kiibist selle järgnevaks
analüüsiks.
Takistada mitte-spetsiifilist sidumist capture agent’ide abil
Kiip peab olema võimeline tegema proteoomi olemasolu
võimalikult nähtavaks.
Kirjastus
Wikipedia =)
Täname tähelepanu eest!