Transcript Teknikat bioteknologjike klasike

Teknikat bioteknologjike klasike
• Teknikat mё tё pёrdorura nё etapёn e parё tё zhvillimit tё BT
janё:




Hibridizimi
Mutacioni dhe pёrzgjedhja
Krijimi dhe shkrirja e protoplasteve
Fiksimi i enzimave dhe qelizave
hibridizimi
• Hybridization—the production of offspring from two animals or
plants
of
different
breeds,
varieties,
or
species
• Nenkupton hibridizim midis llojeve ose shtameve tw ndryshme
• pёrdoren pikёrisht ciklet jetёsore tё majave nga shtame haploide
me veti gjenetike tё njohura, pwr tw dhwnw forma tё reja me
karakteristika tё dёshiruara
• Shembull: kryqёzimi i njё shtami joflokulent ( pa shkumё), qё si
burim karboni pёrdor maltozёn, me njё maja tjetёr qё nuk e ka
vetinё flokuluese, dhe qё nuk e pёrdor maltozёn burim karboni,
mund tё pёrzgjidhet njё shtam diplod qё zotёron tё dy vetite e
dёshiruara (joflokulent, pa maltozwn)
Shfrytёzimi i cikleve jetёsore pёr prodhimin e shtameve diploide
1. hibridizimi
• Megjithatё, problemet janё tё ngjashme me ato tё
kryqёzimeve nga gjenetika klasike,
• Si rrjedhojё sot pёrdoren metodat gjenetike tё modifikimit
molekular tё ADN-sё
• Kjo metodё ka ndihmuar nё njohjen gjenetike tё majave dhe
nё pёrpilimin e hartave gjenetike tё kromozomeve tё tyre
(diplode 32 kromosome)
• Pikёrisht njё numёr i madh gjenesh sic ёshtё ai pёrgjegjёs
pёr flokulimin ёshtё hartuar me rrugёn e hibridizimit
2. Mutacioni dhe pёrzgjedhja (seleksionimi)
• Nё bioteknologji pёrdoren mikroorganizma tё pёrzgjedhura
(pra ku shtami mё i mirё ёshte ai i cili ka veti mё tё mira
prodhuese), me anё tё mutacionit apo seleksionimit
• Si rezultat i hartimit tё programeve tё mutacionit e tё
seleksionit, shumё organizma qё prodhonin lёndё nё sasi tё
vogla lёndё me interes pёr njeriun, (antibiotikё, vitamia,
aminoacide etj.), janё shndёrruar na shtame mё aftёsi tё
lartё prodhuese, qё ende pёrdoren me sukses nё industrinё
e sotme fermentuese.
2. Selection and Mutation
• Selection: Culture a naturally occurring
microbe that produces desired product
• Mutation: Mutagens cause mutations that
might result in a microbe with a desirable trait
• Site-directed mutagenesis: Change a specific
DNA code to change a protein
• Select and culture microbe with the desired
mutation
Pёrparёsitё:
• Me anё tё mutacionit janё pёrftuar m.o tё aftё pёr
pёrdorimin e lёndёve tё para mё pak tё kushtueshme, qё
rriten nё temp. tё ndryshme, apo kultura qё vetinё
shkumёzuese e kanё nё nivele minimale
• Poashtu me anё tё mutacionit mund tё ndёrpritet njё zinxhir
metabolik nё nivele tё ndryshme, gjё qё bёn tё mundur
grumbullimin e produktit tё ndёrmjetёm metabolik, pra nё
disa raste janё lёndё me rendёsi tё lartё industriale
Si induktohet njё mutacion artificialisht ??!
• Qelizat i nёnshtrohen njё lёndё mutagjene fizike
(temperatura, uv ndricim, rrezatim), kimike (ᾳ benzopireni,
produktet policiklike PAH), izolohen mё pas qelizat qё kanё
mbijetuar dhe vlerёsohen vetitё e tyre tё fituara. (SHBA,
Skoci)
• Ku eshte shfrytezuar????
• Qёllimi ishte rritja e rendimentit tё penicilinёs, e dobishme jo
vetёm pёr penicilinёn por edhe pёr antibiotikё tё tjerё
• Shembujt e mёposhtёm:
• Penicillium notatum VS P. chrysogenum
Prodhimi i penicilinёs G dhe i L-lizinёs
• Shtami i egёr i Penicillium notatum, i zbuluar nga Fleming dhe qё
jepte 0,6-1,2 mg penicilinё/liter terreni u zёvendёsua (pwrzgjodh)
nga P. crysogenum, i izoluar ne SHBA
• Me anё tё mutacionit e pёrzgjedhjes u pёrftua njё shtam mutant, i
aftё pёr tё prodhuar rreth 120 mg pen/Litёr terreni, mё pas me
anё tё teknikave pёrzgjedhёse tё njёpasnjёshme, u arrit nё
shtamet e sotme tё prodhojnё deri nё 10 g pen/lit.
• Lizina Lysine is an essential amino acid, which means that the
human body cannot synthesize it. Its codons are AAA and AAG
fitohet me rrugё fermentative nga shtame mutante
Corynebacterium glutamicum qё prodhojnё mbi 40 g lizinё/lit
terren kulturё. (mutantё, me crregullim mekanizmi i kontrollit tё
sasisё sё prodhimit tё lizinёs., mutacion nё gjenet rregullatore)
Penicillium notatum VS P. chrysogenum
Kufizimet e mutacionit dhe perzgjedhjes !!
• Mutacione janё tё rastёsishem dhe jogjithmonё fitohet
mutanti nё zonёn e ADN-sё dёshiruar
• Rrallё herё ndodhё qё tё fitohen mutacione tё njefishta;
• Frekuenca e mutacionit tё dёshiruar ёshtё shumё e ulёt,
procedura e pёrzgjedhjes ёshtё shumё e ulёt
• Qendrueshmёria e shtameve tё ndryshuar ёshtё mё e ulёt se
e atyre natyralё, sepse nuk ёshtё e mundur tё identifikohen
tё gjitha mutacionet e ndodhura edhe pse tё padukshme
3. Protoplastet dhe shkrirja e tyre
Protoplastet?? A protoplast is a plant, bacterial or fungal cell
that had its cell wall completely or partially removed using
either mechanical or enzymatic means.
Enzimat: lizoxima (bakteret), zimoliaza (majatё), celulazat
(bimёt)
Process of Protoplast Fusion
Figure 9.5a
Protoplastet
• Rrugё tjetёr e pёrmirёsimt tё shtameve mikrobike: SHKRIRJA
E PROTOPLASTEVE??
• Rikombinimi i gjeneve me anё tё shkrirjes sё qelizve
vegjetative
• Formohen qeliza heterokariote, qё mund tё bashkojnё
bёrthamat e tyre, tё rikombinojnё gjenet, segregohen mё
pas rikombinantёt
• Protoplastet bashkohen nёn veprimin e njё solucioni
polietilenglikol (PEG), dhe formojna qeliza hibride ku nё tё
njёjtёn citoplazmё gjenden kromozomet nga dy qeliza
gjenetiksht tё ndryshme.
protoplastet
Pwrdorimi i protoplasteve
• Metoda e shkririjes sё protoplasteve ashtu si ajo e
mutagjenezёs ёshtё pёrdorur gjёrёsisht pёr prodhimin e
antibiotikёve dhe lёndёve tё tjera
• Kjo metodё ka dhёnё rezultate tё dukshme nё prodhimin e
antibiotikёve nga bakteret Streptomyces, tё cilё janё
prodhuesit e rreth 60 % tё antiobiotikёve tё njohur dhe tё
disa prej enzimave mё tё rёndёsishme si p.sh glukozё –
izomeraza
• Pёrmirёsimi i shtameve tё ndryshme tё Streptomyces ka
ndikuar nё rendimentin e prodhimit tё rreth 70 antibiotikёve
dhe enzimave
Pwrdorimi i protoplasteve
• Kjo metodё ёshtё pёrdorur edhe nё shtamet fermentuese tё
majave, kёshtu p.sh njё shtam i Saccharomyces cerevisiae u
shkri me njё tё Saccharomyces uvarum; - veti gjenetike tё
dёshiruara tё dy shtameve
• Njёri nga shtamet ishte flokulent por auksotrof??
pёr njё sёrё lёndёsh, shtami tjetёr ishte joflokulent por i aftё
tё prodhontё lёndёt e sipёrpёrmendura, pra nuk kёrkonte
lёndё tё shumta pёr tё u shumuar
• Shtami hibrid FLOKULENT- JOAUKSOTROF
• Nё fushёn e mykeve ёshtё realizuar p.sh skrirja midis dy
specieve gjinive tё Aspergillus dhe Penicillium
protoplastet
vazhdim
• vazhdim
4. Fiksmi i enzimave
• Si burime industriale tё enzimave ekonomikisht tё levёrdishme
shfrytёzohen vetёm disa inde shtazore e bimore
• Shumica e enzimave qё pёrdoren sot janё me orgjinё mikrobike
a) japin njё sasi tё konsiderueshme tё enzimave,
b) nga i njejti mikrob mund tё nxiren disa enzima
Fiksimi i enzimave
Enzimat qw prodhohen: amilaza, pektinazat, celulazat, invertazat,
laktazat, lipazat, aminoacilaza, penicilinaza, katalazat etj.
• Nё shkallё industriale enzimat pёrdoren nё formё tё tretshme,
pra nё tё njёjtёn formё nё tё cilёn ndodhen edhe substratet
mbi tё cilat ato veprojnё
• Pra reaksioni enzimatik ndodh nё fazё tё lёngёt homogjene,
dhe pas transformimit tё plotё tё substratit, pёrzierja qё
pёrmban produktin pёrdoret si e tillё ose trajtohet mё tej pёr
izolimin apo pastrimin e kёtij tё fundit,
Fiksimi i enzimave
• Por nё tё dyja rastet enzima inaktivizohet sepse rikuperimi I
saj eventual do tё ishte I vёshtirё dhe I kushtueshёm po tё
kemi parasysh pёrqёndrimin e saj tё ulёt nё pёrzierjen e e
reaksionit.
• Si rrjedhojё u zhvillua metoda e fiksimit tё enzimave
• ёshtё njё metodё me anё tё sё cilёs enzima detyrohet tё
zhvillojё aktivitetin e saj katalitik nё njё hapёsirё tё kufizuar
por tё ekzpozuar mirё ndaj substratit dhe produktit tё
reaksionit.
Metodat e fiksimit
fizike dhe kimike
• Metodat fizike – metoda e thjeshtё dhe mё ekonomike
bazohet nё a) adsorbimin : molekulat enzimatike fiksohen nё
partikula tё ngurta me natyrё tё ndryshme (qelq poroz,
argjilё, lёndё plastike) por qё mund tё shkёputen nё kushte
tё caktuara
• Metoda tjetёr fizike konsisiton nё b) “gёlltitjen” e enzimёs
me njё polimer natyral ose sintetik
• Pasi nxitet polimerizimi nё prani tё enzimёs, molekulat e
kёtij tё fundit mbeten “tё burgosura” nё rrjetёn
tridimensionale tё formuar nga molekulat e gjat polimerike.
Metodat e fiksimit
• Njё tjetёr metodё fizike ёshtё ajo e c) mikrokapsulimit qё
konsiston nё mbёshtjelljen e enzimёs nё shumё sferula me
pёrmasa tё vogla (diametёr 10- 100μm) paretet e tё cilave
janё shumё tё holla (najlon, kolodium) janё tё pёrshkueshёm
nga ana e molekulave tё substartit dhe tё produkteve tё
reaksionit).
Lёndёt qё pёrdoren mё sё shumti pёr fiksim
Polimeret që shfrytëzohen:
• Alginati
• Agari dhe agaroza
• Karagenan
• Poliakrilamidi
• Poliuretani
• membrana
Metoda fizike dhe kimike e fiksimit tw enzimave
Metodat kimike
• Fiksimi me rrrugё kimike arrihet me anё tё formimit tё
lidhjeve kovalente midis molekulave tё enzimёs dhe tё njё
suporti tё ngurtё zakonisht tё patretshёm nё ujё, p.sh nga
celuloza, kolagjeni, najloni, polesteri etj.
• Meqenёse si grupet funksionale tё enzimave ashtu edhe ato
tё suportit kanё reaktivitet tё ulёt , ёshtё I domosdoshёm
“aktivizimi i tyre
• Veprohet mbi ato tё suportit duke I bёrё tё afta pёr t’u lidhur
me enzimёn nё mёnyrё t qёndrueshme (skema)
Pёrdorimet e enzimave
 Pёr analizat kimo-klinike
 Terapeutike
 Diagnostifikuese
 Kёrkimore
Pёrdorimi i enzimave
• Pёrdorimi nё analizat kimike bazohet na specifitetin e
enzimave,
• Analizat me bazё enzimatike mund tё kryhen nё vёllime
shumё tё vogla
• Pёr pёrcaktimin e uresё nё gjak (azotemia) pёrdoret enzima
ureaza, e cila shpёrbёn uren nё CO2 dhe nё amoniak (NH3),
nga amoniaku mund tё llogaritet sasia e uresё qё e ka dhёnё
atё
Pёrdorimi I enzimave
• Pёrcaktimi I glicemisё nё gjakё, bazohet nё veprimin e dy enzimave
a) glukozё-oksidaza dhe
b) peroksidaza
• E para oksidon glukozёn dhe formon peroksidin e hidrogjenit
(H2O2), e dyta (peroksidaza) pёrdor peroksidin e hidrogjenit nga
reaksioni I parё pёr tё oksiduar njё lёndё pa ngjyrё indikatore e cila
ngjyroset kur kalon nё gjendje tё oksiduar. Intensiteti I ngjyrimit
ёshtё nё pёrpjestim tё drejtё me sasinё e pranishme tё glukozёs nё
gjakё.
• Vlerat normale tё glicemisё me metoda klasike 80-120 mg/100 ml
gjak, ndёrsa vlerat me metoda enzimatike 70-105 mg/100 ml gjak,
pra kjo e fundit ёshtё vlera realisht qё I takon vetёm konc. tё
glukozёs
Perdorimi i enzimave
• Me metoda enzimatike mund tё maten edhe metabolitet e
tjerё tё rёndёsishёm si kolesteroli, trigliceridet, acidi urik, etj.
• Proteazat, pёr qёllime terapeutike
• Enzimё me orgjinё humane qё pёrdoret me sukses nё rastet e
flebiteve , tromboflebiteve ёshtё urokinaza (plasminogen
factor), as an enzyme, it catalyzes the conversion of
plasminogen to plasmin, the major enzyme responsible for
clot breakdown.
• Streptokinaza , e ngjashme me urokinazёn, mё pak specifike,
me orgjinё mikrobike dhe fitohet nga Streptococcus
haemoliticus
Enzimat, pwrdorimi
• Tripsina- ёshtё pёrdorur nё raste analoge, pёr veteitё e saja
antimpiksёse, dhe pёr forcimin e veprimit tё antibiotikёve dhe tё
antikuagullantёve
• Penicilinaza – enzimё e izoluar nga Bacillus licheniformis, qё
aktivizon nё mёnyrё tё shpejtё penicilinёn
• Enzimat proteolitike, amilaza, hemicelulaza e celulaza, janё pёrodur
pёr kurim tё shqetёsimeve tё traktit digjestiv , pankreatiteve,
• Kimotripsina – efekt terapeutik injektohet nё sy pёr tё menjanuar
atё qё njihet si perde e syve (katarakt)
• Hialuronidaza- hidrolizon acidin hialuronik, lehtёson difuzinin e
medikamenteve
• Proteinaza K, -hidrolizin membarnat qelizore, izolimi I AND-sё
• Polimerazat – PCR etj etj etj
Fund