Transcript Sinteza kimike e ADN-sё






Teknikat mё tё pёrdorura nё nivel molekular qё
pёrdoren nё kёrkime tё
bioteknologjisё
molekulare e tё aplikuar:
Sinteza kimike e ADN-sё
Teknikat e pёrcaktimit tё renditjes sё nukleotideve
tё ADN-sё (sekuencimit)
Teknika e PCR-sё (Polymerase Chain Reaction)
Metoda e fitimit tё antitrupave monoklonalё si dhe
pёrdorimet e tyre
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
1






-
Zinxhirёt polinukleotidikё, qё sintetizohen mund tё
pёrdoren pёr qёllime tё shumta:
Pёr tё formuar gjene tё plota apo fragmente tё tyre
Pёr tё amplifikuar fragmente tё caktuara ADN-je
Pёr tё shkaktuar mutacione tё ADN- ja e izoluar
paraprakisht
Si sonda pёr hibridizimnin e ADN-sё
Ku kryhet sinteza kimike e oligonukleotideve?
Nё aparatura tё kompjuterizuara SINTETIZATORE
automatik tё ADN-sё
E pёrbёrё nga njё sёrё pompash dhe valvulash qё
programohen pёr tё futur nё mёnyrё precize tё gjithё
reaktivёt kimik dhe nukleotidet qё zgjasin zinxhirin
oligoinukleotidik.
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
2




Sinteza in vitro kryhet nё drejtimin 3’-5’, cdo hap dhe
kohёzgjatja kontrollohen nё mёnyrё automatike .
Metoda mё e njohur pёr sintetizimin kimik ёshtё ajo e
fosforamiditit
Nucleoside phosphoramidites are derivatives of natural
or synthetic nucleosides. They are used to synthesise
short nucleic acid chains.
Nucleosides are glycosylamines consisting of a
nucleobase (often referred to as simply base) bound to
a ribose or deoxyribose sugar via a beta-glycosidic
linkage. Examples of nucleosides include cytidine,
uridine, adenosine, guanosine, thymidine and inosine.
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
3
SINTETIZATORI OSE SINTIZAJZER
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
4
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
5



Para fillimit tё reaksionit tё gjitha nukleozidet
trajtohen duke zёvendёsuar aminogrupet e bazave
tё tyre me grupe benzoile , qё mos tё vije nё
reaksione tё padёshiruara
Nukleozidi i parё qё do pёrbёjё skajin 3’ tё
zinxhirit sintetizues fillimisht lidhet me njё suport
tё ngurtё (sfera xhami) (fiksim), me ndёrmjetёsin e
njё grupi qё quhet spejser.
Ndёrsa nё skajin 5’ tё kёtij nukleozidi lidhet njё
grup DMT (DIMETOKSITRITIL)., pёr tё mos lejuar qё
ky (nukleozidi) tё hyjё nё lidhje. Ky komponim
quhet edhe komleksi nismёtar i sintezёs kimike.
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
6
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
7





Cdo nukleotid i ri qё do i shtohet kompleksit fillestar
modifikohet duke lidhur nё skajin 5’ njё grup DMT
ndёrsa nё atё 3’ njё grup diizopropilamin (kripe litiumi).
Diisopropylamine is a secondary
formula (CH3)2HC-NH-CH(CH3)2
amine
with
the
chemical
Kjo strukturё e nukleotideve qё shtohen nё reaksion
quhet nukleosid FOSFORAMIDIT, nga emri I metodёs.
Procesi I zgjatjes bazohet nё alternimin e largimit tё
DMT DIMETOKSITRITIL, duke lёnё tё lirё skajin 5’ dhe
shtimin e nukleozideve tё reja nё formёn e
fosforamiditit.
Nga reaksione tё njёpasnjёshme tё kёtij lloji formohet
zinxhiri i plotё i kёrkuar sipas sekuencёs sё kёrkuar
paraprakisht
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
8
The 5'-hydroxyl group is protected by an acid-labile DMT (dimethoxytrityl) group
cytidine, adenosine, guanosine,
thymidine
Bz (benzoyl) protection is used for A, dA, C, and dC, and G and dG are
protected ёith isobutyryl group
Ac (acetyl) group is often used to protect C and dC as shoёn in Figure
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
9
Largimi I DMT
nukleozid
Largimi i diizopropilaminit nga fosforamiditi
Orientimi 3’ 5’
fosforamiditi
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
10
Reaksioni caping dhe oksidimit – nёnkupton
largimin e grupeve metile qё janё tё lidhura nё
grupin fosfat, largimi I grupeve mbrojtёse tё grupit
aminik dhe largimi I DMT-sё
 Pas
kёtyre
reaksioneve
ologonukleotidet
purifikohen
dhe
pёrdoren
pёr
qёllime
e
paracaktuara.
APLIKIMI I OLIGONUKLEOTIDEVE Nё BIOTEKNOLOGJI

teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
11
Ologonukleotidet (having feё, having little) qё
sintetizohen nё mёnyrё sintetike pёrdoren si:
 Sonda pёr eksperimentimin e hibridizimit tё ADNsё
 Si sekuenca prajmere pёr sekuencimin e ADN-sё
 Pёr tё ndryshuar renditjen e gjeneve tё klonuara
 Small interfering RNA

teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
12




Oligonukleotide me zinxhirё tё njёfishtё prej 4060 bazash, mund tё sintetizohen bazuar nё
renditjen e njё aminoacidi
Zinxhirё tё dyfishtё tё ADN-sё linker, (sekuence
palindromike qё mund tё mbyllet nё vetevete, me
pozicione restriktive, mund tё pёrdoren si lidhёs
me vektorё
Oligomere tё pёrbёrёr prej 17-24 nukleotidesh qё
mund tё pёrdoren si prajmerё pёr reaksionet e
sekuencimit tё ADN
Oligomerё me zinxhirё tё njwfishtё mund tё
pёrdoren pёr mutagjenzёn “in vitro”
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
13


Sinteza e gjeneve nga 60-80 cb, fillimisht vargjet
komplementare sintetizohen nё formёn e segmenteve
pёrbёrёse prej njё zinxhiri por qё janё tё
mbivendoshёm njёri mbi tjerin, ndёrhyhet me T4 ligazё
Gjenet mё tё mёdha nga 300 cb, kanё gabime gjatё
sintetizimit in vitro, pёrdoret njё strategji tjetёr: edhe
kёto formohen zinxhirёt e gjatё tё njwfishtё POR
FRAGMENTE JOTёPLOTA, kur komlementohen me njёri
tjetrin ngelin vende qё nuk mbulojnё tё gjithё gjatёsine
e dy vargjeve, NDёRHYHET ME ADN POLIMERAZё-I, qё
“mbushё” hapёsirat e njefishta, ndёrsa T4 ligaza, i lidhё
zonat e kёputura, ky proces quhet asemblim in vitro
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
14
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
15




The term DNA sequencing refers to sequencing
methods for determining the order of the
nucleotide bases—adenine, guanine, cytosine, and
thymine—in a molecule of DNA.
Shfrytёzohet nё: biotechnology, forensic biology
and biological systematics
Teknika mё e njohur ёshtё Maxam dhe Gilbert
(1976) dhe metoda sipas Sanger
Sipas MG, zinxhirit tё ADN-sё qё kёrkohet renditja
shёnohet nё mёnyrё radioaktive nё skajin 5’, mё
pas ADN-ja trajtohet kimisht nё mёnyrё qё tё
prishen lidhjet midis bazave.
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
16


Krijohen kushte tё tilla qё nё katёr reaksione tё
ndryshme pёr, A,G, C,T tё nxitet prerja nё njёrёn
nga bazat.
Pas elektroforezёs nё 4 shirita, vec pёr cdo
reaksion dhe pas autoradiografisё , mund tё
pёrcaktohet renditja e bazave tё zinxhirit tё
analizuar nё drejtimin 3’-5’
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
17


Because the chain-terminator method (or Sanger
method after its developer Frederick Sanger) is
more efficient and uses feёer toxic chemicals and
loёer amounts of radioactivity than the method of
Maxam and Gilbert, it rapidly became the method
of choice. The key principle of the Sanger method
ёas the use of dideoxynucleotide triphosphates
(ddNTPs) as DNA chain terminators
Dideoksinukleotidet janё nukleotide tё sintetizura
nё rrugё kimike ku mungojnё karbonet 2’ dhe 3’ tё
pentozёs
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
18



The classical chain-termination method requires a
single-stranded DNA template, a DNA primer, a DNA
polymerase, radioactively or fluorescently labeled
nucleotides, and modified nucleotides that terminate
DNA strand elongation.
The DNA sample is divided into four separate
sequencing reactions, containing all four of the
standard deoxynucleotides (dATP, dGTP, dCTP and
dTTP) and the DNA polymerase.
To each reaction is added only one of the four
dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP)
ёhich are the chain-terminating nucleotides, lacking a
3'-OH group required for the formation of a
phosphodiester bond betёeen tёo nucleotides, thus
terminating DNA strand extension and resulting in DNA
fragments of varying length.
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
19
• The neёly synthesized and labeled DNA fragments are
heat denatured, and separated by size (ёith a resolution
of just one nucleotide) by gel electrophoresis on a
denaturing polyacrylamide-urea gel ёith each of the four
reactions run in one of four individual lanes (lanes A, T,
G, C);
• the DNA bands are then visualized by autoradiography
or UV light, and the DNA sequence can be directly read
off the X-ray film or gel image.
• In the image on the right, X-ray film ёas exposed to the
gel, and the dark bands correspond to DNA fragments of
different lengths. A dark band in a lane indicates a DNA
fragment that is the result of chain termination after
incorporation of a dideoxynucleotide (ddATP, ddGTP,
ddCTP, or ddTTP). The relative positions of the different
bands among the four lanes are then used to read (from
bottom to top) the DNA sequence
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
20
21
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
DNA
SEKUENCATORI
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
22




Pra sinteza do tё ndalet nё nivelin e cdo baze tё atij
lloji,
Pra pritet qё p.sh nё tubin e reaksionit pёr adeninёn do
formohen zinxhirё me gjatёsi progresive sinteza e tё
cilёve ndalet nё cdo bazё adeninё qё ajo has.
Ndahet zinxhiri I dyfishte me FORMAMID, dhe mё pas
nё zhel polakrilamid (aftesi tё lartё fraksionuese dhjetra
baza), dhe bandat bёhen tё dukshme ose me antё tё
radiografisё ose me anё tё ngjyrosjes specifike.
Sot, nё metodёn Sanger shfrytёzohet shenues
fluoreshent nё vend radioaktivё, pёr cdo bazё. Kjo ka
bёrё tё mundur automatizimin e kёsaj metode.
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
23


Dideoksinukleotidet janё nukleotide tё sintetizura nё
rrugё kimike ku mungpjnё karbonet 2’ dhe 3’ tё
pentozёs
Dezoksiribonukleotidet natyrale grupin hidroksil e kanё
nё pozcionin 3’ (kujto 5’-3’), pra grupi 3’OH ёshtё
grupi reaktiv qё mer pjesё nё lidhjen midis nukleotideve
nё sintesёn normale tё AND-sё in vivo. Kjo do tё thotё
se nёsё inkoroporohet njё dideoksinukleotid , zinxhiri
nuk ёshtё mё nё gjёndje tё zgjatet.


Nё kёtё metodё fillimisht ndahen zinxhirёt, njёri nga
vargjet I nёnshtrohet reaksioneve tё sekuencimit.
Fillimisht, nё zinxhirin e reaksioneve njёrit varg
(zinxhirit ta njfishtё) tё ADN-sё I shtohet njё
oligonukleotid qё do tё shёrbejё si prajmer pёr tё
vazhduar sintetizimin.
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
24



Nё
cdo
tub
reaksioni
shtohen
tё
gjitha
dezoksirbonukleotidtrifosfatet
(dNTP),
dATP,
dTTP,dCTP, dhe dGTP, ku vetёm njёri ёshtё I shёnuar nё
secilin prej reaksioneve me lёndё radioaktive
ose
joradioaktive, dhe nё secilin tub ne vecanti shtohet nga
njёri prej dideoksiribonukleotidtrifosfateve
ddATP,
ddTTP, ddGTP, ddCTP, nё pёrqёndrime tё tilla qё tё
mund tё inkorporohen nё zinxhirin nё rritje nё tё gjitha
vendet e mundshme pёr to.
Pas reaksioneve nё secilin prej tubave nё prani tё ADNpolimerazёs, do tё ndodhё procesi i zgjatjes sё
zinxhirёve tё rinj deri sa reaksioniinkorporon nje dd.
PёRPARёSI:
Sekuencohet
edhe
ARN,
revesrz
transkriptaza pёr tё kthyer ne cDNA komplementare.,
mё pas behet sekuencimi si mё lartё.
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
25
Me metodёn:
 Pёrdorimi I fagut M13, sekuencohen deri nё 500
cb,
 Dhe primer ёalking, disa mijёra CB , prajmer qё
ecin, sintetizohen prajmer qё drejtojnё sintezёn nё
200-250 nukleotide.

teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
26



Metoda e reaksionit zinxhirё tё polimerazёs, pёrdoret
pёr amplifikimin (shumimin) e fragmenteve tё interesit
tё ADN-sё, deri nё miliona kopje in vitro .
Zbuluesi i kёsaj metode Kary Mullis, fitues i çmimit
Nobёl me dr. Micheal Smith, nё kiminё e acideve
nukleike.
Parakushti kryesor pёr shumimin e fragmentit tё ADNsё ёshtё njohja e sё paku njё pjese tё vogёl tё
sekuencёs nukleotide qё mundёson sintezёn e
sekuencave
oligonukleotideve
komplementare
njёzinxhirore, pra sic njihen ndryshe “primer” me 3OH
fund.
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
27
Çfar duhet pёr reaksionin fillestar tё PCR-sё?
 Molekulё e ADN-sё me njё gjen ose sekuencёn
target tё cilёn duam tё amplifikojmё
 Tё
katёr deoksiribonukleotidtrifosfatet (dATP,
dGTP, dCTP, dTTP)
 Sekuencat
fillestare
tё
oligonukleotideve
(prajmerёt)
 dhe ADN polimeraza (zakonisht Taq polimeraza)

teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
28
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
29
Njё pёrzierje e pёr PCR nё 25 uL konsiston nё:
1. QH2O 15,5 μL
2. Master mix 8,0 μL (5 x puffer TaqMaster, 10 pufer,
dNTP (10mM)
3. Primer nga secili 0,5 μL
4. ADN nga 0.5 μL
5. Polimerza Taq 0.5 μL
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
30
GeneAmp PCR System 2400 (Applied
Biosysytems)
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
31
t° denaturimit
t° e elongacionit
t° e hibridizimit
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
32


Pёr detektimin e sasive tё vogla tё AND-sё nё kampione
si floku, sasi shumё tё vogla gjaku, kocka shumё tё
vjetra, pjesё indesh tё degjeneruara, nё diagnostifikimin
e sёmundjeve gjentike, identifikimin e mutacioneve,
detektimi I baktereve, viruseve, nё industrinё
ushёimore, sondave molekulare , revolucion nё
bilogjinё eksperimentale
These include DNA cloning for sequencing, DNA-based
phylogeny, or functional analysis of genes; the
diagnosis of hereditary diseases; the identification of
genetic fingerprints (used in forensic sciences and
paternity testing); and the detection and diagnosis of
infectious diseases.
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
33

Second part next week
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
34



Monoclonal antibodies (mAb or moAb) are monospecific
antibodies (proteina specifike) that are the same
because they are made by identical immune cells that
are all clones of a unique parent cell.
Si formohen nё rrugё in vitro: qelizat e mielomёs sё
miut (tumorale qё shumohen nё mёnyrё tё
pakontrolluar, por nuk prodhojnё antitrupa) u shkrinё
me qeliza normale tё shpretkёs tё marra nga njё mi i
imunizuar ndaj njё antigjeni tё dhёnё. Kёto tё fundit
prodhojnё antitrupat specifik ndaj antigjenit specifik,
por nuk riten shpejt.
Nga fuzionimi e kёtyre qelizave u fituan qeliza hibride
somatike (HIBRIDOMAT) ku ishin tё kombinuara cilёsitё
pozitive tё tё dyja qelizave.
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
35
(hipoksantinё-aminopterine-
timidinё)
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
36



Detektimi i antitrupave tё cliruar nga qelizat
prodhuese
Lidhja e antitrupit me antigjenin me tё cilin ёshtё
inokuluar kafsha nga janё nxjerrё qelizat fillestare,
Lidhja antigjen-antitrup ёshtё e qёndrueshme dhe
pas lidhjes me njё antitrup sekondar vihet nё
dukje prania e antitrupit tё deshiruar. Antitrupi
sekondar lidhet mё njё enzimё, qё shndron njё
substrat pa ngjyrё nё substrat tё ngjyrosur. Pra
klonet qё shfaqin substrta tё ngjyrosur janё linjat
hibride antitrup prodhuese tё dёshiruara.
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
37
1. Pёrdoren pёr ndarjen e interferoneve (Interferons
(IFNs) are proteins made and released by
lymphocytes in response to the presence of
pathogens—such
as
viruses,
bacteria,
or
parasites—or tumor cells) nga qelizat.
 Antitrupi
monoklonal lidhet pёr interferonin
specifik, ne kromatografine nёkollonё. (bёhet
shpёrlarja e interferonit nga antitrupi, pastrim
5000 herё mё I lartё se cdo rrugё tjetёr.
2. Pёr tipizimin qelizor – AM pёrbёjnё mjete shumё
specifike pёr identifikimin e antigjeneve specifikё
tumoralё nё melanomat, karcinomat, etj.
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
38
3. Nё diagnostikё dhe terapi, - identifikimi i viruseve
ose baktereve nё nja material biologjik nёse ёshtё I
disponueshёm antitrupi specifik ndaj tij.
Lidhja e antitrupave monoklonalё me antigjenen
specifike tё disa tumoreve humane , si p.sh atё tё
antimielomёs etj.
teknikat molekulare tё kёrkimit
2011/2012
39