Transcript Hibridizimi i acideve nukleike










Zhvillimi bioteknologjisë molekulare
Metodat e studimit të qelizave
Teknika e veçimit me centrifugim
Kromatografia
Elektroforeza e proteinave
Përcaktimi i peshës molekulare me anë të
elektroforezës
Elektroforeza e acideve nukleike
Detektimi ADN-së
Hibridizimi i acideve nukleike



m.o dhe qelizat eukariote si “fabrika biologjike” për
prodhimin e lëndëve të tilla si insulina, interferoni,
hormin i rritjes, antigjenet vilare, dhe një sërë
proteinash
Bimët dhe kafshët janë shndërruar në bioreaktorë
natyralë që prodhojnë proteina nga gjene të reja
ose të ndryshuara
Vënia e teknologjive të reja gjenetike-molekulare
në shërbim të bioteknologjisë, çoi në lindjen e një
drejtimi të ri rq quajtur Bioteknologji Molekulare

Biologjia molekulare mikrobiologjia biokimia gjenetika inxhineria
gjenetike
BIOTEKNOLGJIA MOLEKULARE
USHQIM
Medikament
mjedis
vaksina
diagnostike
blegtori







1943 penicilina prodhohet në shkallë industriale
1944 Avery, McCarty vërtetuan se ADN-ja është
materiale gjenetik
1953 Watson dhe Crick përcaktuan strukturën e
ADN-së
1966 Deshifrohet kodi gjenetik
1970 Izolohet enzima e parë e restriksionit
1973 Boer dhe Kohen stabilizojnë teknolgjinë e
ADN-së rikombinante
1978 Genetech prodhon insulin e njeriut në E.Coli





1981 – prodhohet sekuencatori i parë automatik i
ADN-së
1988 – publikohet metoda e PCR
1990 – në SHBA jepet leja për përdorimin e
metodave të terapisë gjenike në qelizat somatike
1997 klonimi i deles Doly
2000 -2001 sekuencimi i gjenomit human
Metodat e reja të biologjisë molekulare kanë
ndikuar në njohjen e ndërtimit, funksionit dhe të
mekanizmave rregullues qelizorë
Konsiston nw :
 Vecimin e pjesëve të ndryshme qelizore
 Teknikat: centrifugimi, kromatografia,
elektroforeza





Fillimisht
suspensioni
qelizor
trajtohet
mekanikisht, bluhet, formohet ekstrakt qelizor
Ekstrakti
qelizor,
nënshtrohet
centrifugimit,
fillimisht me numër të vogël rrotullimesh
Meret një sediment kryesisht nga mbetje të rënda,
ndërsa pjesa e lëngët supernatanti përmban
fragmente më të lehta mebrana, ribozome etj.
Supernatanti centrifuhoehet më tej për të vecuar
përbërësit e tjerë, me anë të ultracentrifugave,
shpejtësi shumë e lartë dhe në të temp. të caktuara
ftohes +4 Gradë, që nuk lejon dëmtimin e pjesëve
qelizore, nga nxehtësia e prodhuar.



Teknika e ndarjes: Ultracentrifugimit të një
përzierje proteinash (ADN) në një gradient
saharoze, ku përqëndrimi tij (saharozws) është më
i ulët në anën e grykës së epruvetës dhe më i lartë
në anën e fundit të epruvetës.
Me anë të centrifugimit të përzierjes proteinike për
një kohë të gjatë në një gradient të tillë proteinat
zhvendosen migrojnë në masë të ndryshme sipas
peshës së tyre; ato ndalen në atë nivel ku densiteti
i tyre përputhet me densitetin e saharozës në të
njëjtin nivel.
Formohen shtresa (unaza) në tub dhe mund të
vecohen me anë të kullimit.


Ndarja e lendeve me metode kromatografike
bazohet nw ndarjen e ndryshme tw lendeve
midis dy fazave tw sistemit : fazws tw
palevishme (stacionare) dhe fazes te
levizeshme (mobile)
Procesi i ndarjes se lendes bazohet ne njw
nga parimet fizikale: adsorbim, ndarja bazuar
ne madhesoine e molekulave, si dhe
kembimit jonik





Teknikë për ndarjen e proteinave nga një ekstrakt
qelizor
Kromatografia në kollonë është më e përdorshmja për
fitimin në gjendje të pastër të proteinave.
Aparati kromatografik përbëhet nga një kollonë qelqi që
mbushet me një lëndë të ngurtë të përshkueshme, me
molekula me përmasa të ndryshme, e zhytur në një
tretës të caktuar
Nga ana e sipërme shtohet përzierja që duhet të ndahet
, dhe kalon përmes matriksit që mbush kollonën.
Parimi i ndarjes së proteinave është ndryshëm; ato
mund të ndahen në bazë të; përmasës së tyre, të
ngarkesës elektrike, ose lidhen në mënyrë specifike me
lëndë “kapëse” që ndodhen në matriksin e kollonës



Kjo e fundit quhet kromatografia me afinitet dhe
për këtë zakonisht përdoren enzima specifike për
proteinën që kërokohet të vecohet.
Në një hap të dytë me anë të tretësve ose të
lëndëve specifike bëhet ndarja ose shkëputja e
enzimave nga proteina.
figura





është një tjetër metodë për ndarjen e fraksioneve
qelizore sidomos të proteinave dhe acideve nukleike
molekulat migrojnë në një fushë elektrike sipas
ngarkesës së tyre, përmasave dhe formës
Për përcaktimin e peshës molekulare, proteina fillimisht
denatyrohet me nje detergjent dhe më pas i nështrohet
elektroforezës.
Proteinat lëvizin nën fushën elektrike të drejtuara nga
përmasat
Duke matur masën e levizjes së një proteine apo të një
përzierje proteinash në raport me një proteinë standarte
me parmasa të njohura



Ku ngarkohen (loading) proteinat e denatyrura ? Në
zhel poliakrilamid ose në agar
Pas elektroforezës zheli ngjyroset me ngjyrues
specifik për proteinat që bën të mundur
vizualizimin e bandave të proteinave të ndara,
kështu përcaktohet masa molekulare e tyre (shiko
figuren lartë).
Proteinat mund të ndahen edhe varësi të ngarkesës
së tyre elektrike, kjo ngarkesë shprehet me anë të
pikës së tyre izoelektrike d.m.th vlera e pH ku
proteinat nuk kanë ngarkesë elektrike
Teknika quhet: teknika e fokusimit izoelektrik, ku
proteinat lëvizin në një gradient pH, d.m.th cdo
proteinë lëviz dhe ndalet në zhel në pikën ku vlera
e pH përputhet me atë izoelektrike të proteinës
(pra në pH ku nuk ka ngarkesë elektrike)
Me këtë elektroforezë mundësohet ndarja e
përzierjeve që përmbajnë deri në qindra ose mijëra
proteina të ndryshme, p.sh ekstarktet qelizore

Çfar pёrfaqёson elektroforeza?

Zhel elektroforeza me agarozё ёshtё metoda qё
shfrytёzohet nё biokimi dhe biologjinё molekulare
pёr tё fraksionuar molekulat e ADN, ARN-sё sipas
madhёsisё sё tyre nё çb (çifte bazash nga 20-30
kb). Kjo realizohet duke migruar molekulat e
ngarkuara negativisht tё acideve nukleike pёrmes
njё matriksi agaroze nёn veprimin e fushёs
elektrike (electrophoresis). Fragmentet e shkurtёra
lёvizin mё shpejt dhe migrojnё mё gjatё se
fragmentet gjata. Sambrook J, Russel Dё (2001)






Metodat e studimit të acideve nukleike
Ekstarktimi I ADN-së
Trajtimi e qelizave me enzima (proteinaza K), që
tret membrabat qelizore, dhe me ARN-azë
Metoda Fenol-kloroform
Ekstraktohet ne fund me etanol 96%
Në fund centrifugohet,
16000 rot/25 min,
fundrina pra ADN-ja tretet me tris EDTA ose me
H2O te distiliuar



Spektrofotometria- veti e ADN-së për të thithur
rrezatimin UV në gjatësinë 260 nm, kjo thithje I
dedikohet bazave purin dhe pirimidine
Zinxhiri I dyfishtë ka absorbancë më të ulët se
zinxhiri I njëfishtë
Centrifugimi I AND-së në gradient të CsCl,





Molekulat e AND-së kanë densitet të ndryshëm,
Ciftet G-C në raport me ato A-T kanë një densitet më të
lartë se A-T
Ky densitet i molekulave të AND-së mund të
përcaktohet me anë të centrifugimit të saj në shpejtësi
shumë të larta në një gradient të CsCl
Solucioni I ADN-së shtresëzohet mbi një solucion të
CsCl, dhe centrifugohet në një shpejtësi të lartë deri sa
të arrihet gjendja e ekuilibrit
CsCl formon një gradient në rritje nga filimi deri në
fund të epruvetës, ndërkohë mol. E AND-së
pozicionohen ndaken në atë të përqëndrimit të CsCl që
përputhet me densitetin e tyre



Kur molekulat e ADN-së
kanë densitet të
ndryshëm, në ekuilibër do të meren një sërë
bandash të ADN-së, ku më e rënda migron më
shumë ndërsa me e leha më pak
Më pas në solucion shtohet BrEtidiumi dhe bandat
e ADN-së bëhen të dukshme me shtresa
flouroshente, kur epruveta shihet nën rreze UV.
Me anë të thithjes, bandat mund të tërhiqen në
formë të vecuara nga njëra tjetra

elektroforeza

kualitetin e ADN-sё sё izoluar nga indet tumorale
dhe jotumorale detektohet me anё tё
zhel
elektroforezёs agarozё zakonisht me pёrqёndrim
2% .




AND-ja kur trajtohet me ngjyrues fluoroshent ,
vërehet falë fluoroshencës së këtyre ngjyruesve
specifike
Bromuri i etidiumit, kancerogjen, nderfutet ne
strukturën e ADN-së
Nëse shikohet nën UV rreze, bandat (shiritat) e saja
behen te dukshme
figura
Standarti
Ose markeri






Radioaktiviteti përdoret shumë në fushën kërkimore të
acideve nukleike
Acidet nukleike të radioaktivizuara mund të detektohen
me anë të autoradiografisë
Rrugët pqr shënimin radioaktiv të acideve nukleike:
Ndërfutja e
fosfatit radioaktiv, gjatë kryerjes së
sintezës së acideve nukleike (sintetizohen zinxhirë
radioaktive) P32
shtimi I ATP-së radioaktive në fund të AND-së, më anë
të enzimës polinukleotid-kinaza, ku fosfati I trete I ATP,
transferohet në grupin OH të skajit 5’ të mol, së ANDsë
Shënimi qëndror me anë të sintetizimit in vitro në prani
të nukleotideve radioaktive







Me nxehje prishen lidhejt hidrogjenore
Ngrohja con në denatyrim I ADN-së
Sa më fortë mbahen vargjet me njëri tjetrin aq më e
fortë duhet të jetë tepm. e denatyrimit
Në këtë veti ndikon përmabjtja relative A-T / G-C,
duke ditur që ciftet A-T kanë dy lidhje
hidrogjenore, dhe G-C tre lidhje të tilla.
Prishja e vargjeve të ADN-së mund të ndiqet me
anë të ndryshimit të absorbancës së saj, (spektro)
Me rritjen e temp, absorbanca ka ulje, maximumi I
absorbancës kur vargjet janë ndarë plotëshit
Me uljen e Temp, ADN-ja fillo të rinatyrohet








Hibridizimi i ADN-së, ndërimi I vargjeve të
dyfishta nga një zinxhirë primar
Rinatyrimi I AND-së
Mund të formohen cifte ADN_-AND, ARN-ARN
Teknikë për njohjen e gjeneve
Bën të mundur kapjen apo identifikimin e nje
fragmenti të interesit
Kapja bëhet me anë te fragementeve që u njihet
radhitja SONDA,
Sondat radioaktive,
Hibridizimi mund të behet edhe poas një
elektroforeze ne zhel

fund