Transcript Slayt 1

Viral Hepatitlerde Dendritik
Hücre Bazlı Tedaviler
Prof.Dr.Ercüment Ovalı
KTÜ-Ati Teknoloji Proje sorumlusu
Günümüzde viral ve maling hastalıkların
tedavisinde çok önemli gelişmeler olmasına
rağmen,
Mevcut tedavilerin yeterli olduğunu söylemek
mümkün değildir
Bu durumda farklı tedavi seçeneklerine
gereksinim vardır
Bu seçeneklerden biri immünoterapi
uygulamalarıdır.
Kullanılan immünoterapi rejimlerinden biride
DENDRİTİK HÜCRE
bazlı uygulamalardır.
• Dentritik hücreler profesyonel antijen
sunan hücrelerdir(ASH).
• ASH içinde kendisine en yakın rakibinden
100 kat daha güçlü bir şekildeT lenfositleri
uyarabilmektedirler .
DH’nin Öyküsü
• 19. yüzyılada Paul Langerhans LH’ni
tanımladı
• 1973’de Stainman bu hücreler için DH
tanımını kullandı
• 1990’lı yıllarda DH kök hücreden ve
monositlerden üretilmeye başlandı
• 2000 yılıdan sonra ilk klinik çalışmalar
başladı
DH’nin kaynağı
•
DH’ler heterojen bir grup hücre olup kemik iliğinden
Değişik büyüme faktörlerinin(flt3-l, GM-CSF vb)
varlığında oluşurlar.
•
Periferik kanda ise DH’ler HLA-DR pozitif olup CD11c
ve CD123 varlığına göre iki ayrı gruba ayrılırlar
–
–
Myeloit DH
: CD 11c pozitif CD123 negatif (DC1)
Plazmasitoit DH:CD11c negatif CD123 pozitif(DC2).
Yung JW. ASH Education program book. San Francisco, California December 1-5. p:361-366: 2000
Osada T et al. Rev. Immunol. 25:377-413:2006
Morfolojik Karakterleri
• İsimlerinin tanımladığı gibi tüyümsü çıkıntıları olan , oval
çekirdekli iyi gelişmiş ER’ye sahip hücrelerdir.
• Plazmastoit tipi ise plazma hücresine benzer
Fonksiyonel Karakterleri
• 3 farklı fonksiyonel karaktere sahiptirler:
– T hücre uyarımı
– İmmün toleransın indüklenmesi
– B hücre fonksiyonlarının düzenlenmesi
Dendritik Hücre Bazlı tedaviler
• Bir çok olguda immün sistem tümörü/viral yükü eradike
edemez. Buda tümörün yayılması ile sonuçlanır. Çünkü:
Tümör İmmün Kontrolden saklanmaktadır.
A-Tümörün gizlenmesi
1- Costimulatuar molekül ekspresyonunu azaltırlar
2- MHC I ve II eksp. azaltır.
3- Target antijen genlerini baskılarlar
B-İmmün supresyon indüksiyonu
1- IL-10 sekresyonunu artırırlar
Th3tip yanıt(Treg)
2- TGF beta sekresyonunu artırırlar
3- Solubıl ihibitörleri artırırlar)(iNOS,ARG-1).
4- Fas-L salgısını artırırlar.
5- Hızlı proliferasyonla toleransı indüklerler
Viral yükün eradike edilememe nedenleri
• Yetersiz immün yanıt(özellikle akut fazın
semptomatik geçtiği hastalarda viral yük
daha yüksek olmaktadır) (Thimme et al., 2001)
• T lenfosit epitoplarında mutasyonlar (Erickson et
al., 2001; Weiner et al., 1995);
• Viral proteinlerle immün yanıtın
baskılanması (Gale et al., 1997; Keskinen et al., 2002;Kittlesen et al.,
2000).
• APC, Hücresel yanıtın bozuk olması (Cooper et
al., 1999; Thimme et al., 2002);
• DH ise klas I ,II ve
costimülatuar
moleküller yüksek
oranda taşır.
• Ve istenirse Th1
ve/veya Th2 yanıtı
indükleyebilir
DH’lerin elde edilmesi
• Üretim
• İzolasyon
Üretim
•
CD 34 kök hücrelerden DH Üretimi:
–
•
Monositlerden DH üretimi:
–
•
Flt3L, IL-3 and IL-6, ile 14 günlük bir inkübasyon sonrası
IL-4 and GM-CSF 3 günlük yeni besleme süreci
En popüler olan bu metot da hücreler IL-4, GM-CSF ile 7
gün inkübe edilirler.
Neoplastik Hücrelerden DH üretimi:
–
Neoplastic DH’ler ALL,AML,KML hücrelerinden GM-CSF,
IL-4, TNF-α ve CD 40L varlığında üretilebilmektedir.
Osada T, et al.Inter Rev Immunol 2006;25:377–413)
Curti A, et al.J Immunol.2001;166:848–854.
Ovalı E,et al.Haematologica.2000; 85:464–469
DH İzolasyonu
• Periferik kanda 3 x 106 to 17 x106/litre
• Lokoferezis ile 1 x106 to 10 x106 toplanabilir
• Ancak yeterli olmadığından G-CSF,GMCSF,progenipoetin bu amaçla kullanılabilir
Osada T, et al.Inter Rev Immunol 2006;25:377–413)
Pullarkat V, et al.Clin Cancer Res.2003; 9:1301–1312
Lonial S, et al.Biol Blood Marrow Transplant 2004; 10:848–857
Kültür özellikleri
• Başlangıçta fetal calf serum (FCS) kullanılmış
yaşanan sorunlar nedeniyle otolog seruma(OS)
dönülmüştür.
– Ancak hasta serumlarının IL-10, TGF-β gibi solubıl
inhibitörleri barındırmaları olasıdır
• Bu nedenle serum free media kullanımı
önerilmektedir.
Osada T, et al.Inter Rev Immunol 2006;25:377–413)
Yüklemede Kullanılan Antijenler
• Tanımlanmış antijenler:Peptitler, proteinler,
cDNA,
• Tanımlanmamış antijenler : Tumor hücreleri,
tumor lysates, heat-shock proteins, tumor / DC
fusions and mRNAs, İnaktive Virüsler.
• Yardımcı epitoplar:Keyhold limpet haemocyanin
(KLH), tuberculosis purified protein derivate
(PPD), Pan-HLA-DR binding protein (PADRE)
Osada T, et al.Inter Rev Immunol 2006;25:377–413)
Schnurr M, et al.Cancer Res 2001; 61:6445–6450
Wierecky J, Cancer Res 2006; 66:5910–5918.
Ovali E, et al.J Exp Clin Cancer Res 2007; 26:209–214
DH Maturasyonu
• Aşılar için mutlaka matür DH ler kullanılmalıdır.
• TNFα, IL1β, IL-6 ve PGE2 standart maturasyon
reagentlarıdır. Ama???
• Hepatocyte growth factor (HGF)Hem CD34
pozitif hücrelerden hemde monositlerden
oluşan DH lerin maturasyonunda katkıda
bulunabilmektedir.
Schuler-Thurner B, et al. J Exp Med 2002;195:1279–1288
Ovali E,et al.Haematologica.2000; 85:464–469
McIlroy D, Gregoire M: Cancer Immunol Immunother 2003; 52:583–591
Sonmez M, et al.Saudi Med J 2007; 28:688–695
Ovali E, et al.J Exp Clin Cancer Res 2007; 26:209–214
Otoriteler
İşlem
- Kemik iliği nakli
- Kan, Kİ, GKK hemopoietik kök hücre
- Hücre tedavileri için hücrelere
yapılacak her türlü işlem:
Çok
Kan bankacılığı,
Tüp bebek uygulamaları,
İmmunoterapi uygulamaları
Diğer hücre tedavi ürünleri
- Gen tedavi ürünleri
Asgari şart
Aseptik teknikler yeterli
Release Tests of DCs based vaccine products
(Hinz T,et al. J Immunother 2006;29:472–476,Brent M.Annual Somatic Cell Therapy Symposium,
9/25-27/2006. Osada T, et al.Inter Rev Immunol 2006;25:377–413)
Purity(as measured by flow cytometry) :
>50 %HLA DR , CD86, CD 11c/CD 123 positive
Viability:
>% 70 by trypan blue exclusion or Propidium iodide stain
Sterilty:
Bacteria, fungus, mycoplasma negative
Pyrogenitiy:
Endotoxin negative by LAL
Differentiation/Maturation(optional):
Linage negative and CD80, CD83 positive (as measured by flow cytometry).
Potency testings( To be developed and defined by product manufacturer):
High level of target protein expression (Threshold is yet to be determined)
CD45 positivity *
Mixed lymphocyte reaction
Costim assay .
Stability assay
To be defined by product manufacturer.
Functional assays (Late phase clinical development)
Delayed type hypersensitivity reaction(DTH)
ELISPOT
Tetramer staining by flow cytometry
DH Bazlı Aşı Uygulaması
• Optimal doz ve uygulama sıklığı :
– Bilinmemektedir.
• Önerilen ilk dozların 15 günde bir olmasıdır
• En az 5 milyon hücre önerilmekte olup ilk veriler 20 Milyon hücrenin
optimal olacağını işaret etmektedir
– Uzamış uygulamaların etkinliği artıracağı gösterilmiştir
• Uygulama şekli
– SC,İD,İN uygulamalar: T hücre uyarımı için
– İV uygulamalar ise B hücreleri uyarmak için tercih
edilmektedir
Ovali E, et al.J Exp Clin Cancer Res 2007; 26:209–214
Osada T, et al.Inter Rev Immunol 2006;25:377–413
Yapılan Araştırmalar
• Bugün değişik türdeki kanser aşılarının
tamamlanmış 7 adet Faz III çalışması vardır
• Ancak DH aşıları ile ilgili 100den fazla faz I/II bir
adette Faz III çalışma mevcuttur. Hepsinin ortak
sonucu:
– Kanser aşıları emniyetli bir uygulamadır. Dünya
literatüründe bir çalışmada Grade III toksite rapor edilmiş diğer tüm
çalışmalarda sadece Grade I toksite rapor edilmektedir
– Objektif klinik cevap oranları %2.6-%32 arasında
rapor edilmektedir.
Freda K. Stevenson Curr Opin Oncol 17:573—577.2005
Faz III Çalışmalar
Doehn Ch, Richter A, Lehmacher W, Jocham D.
Adjuvant autologous tumour cell-lysate vaccine versus no adjuvant treatment in patients with M0
renal cell carcinoma after radical nephrectomy: 3-year interim analysis of a German multicentre
phase-III trial.
Folia Biol (Praha). 2003;49(2):69-73.
Schadendorf D, Ugurel S, Schuler-Thurner B, Nestle FO, DC study group of the DeCOG. Dacarbazine
(DTIC) versus vaccination with autologous peptide-pulsed dendritic cells (DC) in first-line
treatment of patients with metastatic melanoma: a randomized phase III trial of the DC study
group of the DeCOG.Ann Oncol. 2006 Apr;17(4):563-70. Epub 2006 Jan 17.
Hanna MG Jr, Hoover HC Jr, Vermorken JB, Harris JE, Pinedo et al,
Adjuvant active specific immunotherapy of stage II and stage III colon cancer with an autologous
tumor cell vaccine: first randomized phase III trials show promise. Vaccine. 2001 Mar 21;19(1719):2576-82.
Jocham D, Richter A, Hoffmann L, Iwig K, Fahlenkamp D, et al.
Adjuvant autologous renal tumour cell vaccine and risk of tumour progression in patients with
renal-cell carcinoma after radical nephrectomy:Phase III, Randomised controlled trial.Lancet.
2004;363(9409):594-9.
•
[No authors listed]
Phase III randomized study of autologous lymphoma-derived idiotype specific
vaccination plus GM-CSF in patients with follicular lymphoma in first complete
remission.Clin Adv Hematol Oncol. 2003 Jan;1(1):67.
•
O'Brien ME, Anderson H, Kaukel E, O'Byrne K, Pawlicki M, Von Pawel J,
Reck M; SR-ON-12 Study Group.
SRL172 (killed Mycobacterium vaccae) in addition to standard
chemotherapy improves quality of life without affecting survival, in patients
with advanced non-small-cell lung cancer: phase III results.
Ann Oncol. 2004 Jun;15(6):906-14.
•
Wallack MK, Sivanandham M, Ditaranto K, Shaw P, Balch CM, Urist MM,
Bland KI, Murray D, Robinson WA, Flaherty L, Richards JM, Rosen L,
Bartolucci AA. Increased survival of patients treated with a vaccinia
melanoma oncolysate vaccine: second interim analysis of data from a
phase III, multi-institutional trial.
Ann Surg. 1997 Aug;226(2):198-206.
1200
50
45
40
35
800
30
600
CEA
calcitonin
1000
Vaccine protocol
25
20
400
Vaccine protocol
15
200
10
5
0
0
50
100
150
200
Time(day)
250
300
350
400
0
0
50
100
150
200
Time(day)
250
300
350
400
Enfeksiyon - DH tedavisi
?
DH’lerin
mikroorganizmalara karşı
konak savunmasını güçlendirme veya
kronik tabiatlı
(HIV, HBV, HCV, papilloma, CMV gibi)
mevcut bir enfeksiyonun
tedavisinde kullanılabilir mi?
İlk DH aşısı örneği:
spiroketlere karşı uygulanmış;
B. burgdorferi yüklenmiş DH’ler farelerde
spesifik koruyucu bağışık yanıt oluşturmuştur (Mbow et al. 1997)
LCMV peptid-yüklü DH’ler
Farelerde; çok kısa bir sürede (2 gün)
güçlü ve uzun (>60 gün) süreli
bir antiviral yanıt oluşturmuştur (Ludewig ve ark. (1998)
influenza
ve HSV-2 proteinleri ile yüklenmiş DH
aşılarının (Schon et al. 2001) spesifik T hücre ve
koruyucu yanıt oluşturdukları gösterilmiştir.
(Lopez et al. 2000)
Andriew JM ve ark. Nat Med 2003;
• SIV yüklü DH ile aşılanan 10 maymundan
7’sinde Plazma viral yük 1000 kat azalmış.
• Etkinlik 1 seneden uzun sürmüş.
Andriev JM ve ark-Nature. 2004
• 18 ART tedavisi almayan hastaya HIV-1 yüklü DH aşısı
uygulamış 1 yıl sonra 8’inde viral yükün %90’nın altına
inmiş olduğu 4’de ise 1000 kopya/100mikrolitre olduğu
saptanmış
-180
0
90
180
360
kronik HIV enfeksiyonunda
HIVgag
yüklü DH aşısı,
DHpeptid
aşısı insanlarda;
HAART kullanılan emniyetli
hastalardabulunmuş,
viral reboundu baskılamada
yetersiz
kalsa dagüçlü
spesifik
oluşturduğu,
çoğu hastada
bir Tyanıt
hücre
yanıtı ve
virus/DH
viral Iİİ
yükte
düşüşçalışmasında
sağlamıştır (Luise
et al. 2004).
spesifik hücresel yanıtın zayıf ve geçici olduğu bildirilmiştir.
İki farklı grup tarafından;
HIV-1gag,
env veilepol
peptid yüklü
DHyüklenerek
aşısı
biri HIVgag
peptidleri
diğerinde
Iİİ virus
HIV-1+ hastalarda;
hazırlanmış
DH’ler,
iyi tolere
edildiği
ve ayrıca
kısa uygulanmış;
sürede
HAART
tedavisi
altındaki
hastalara
HIV
spesifikiyiIFNg+
oluşturmuştur
(Connoly
et al.
2007)
aşılarının
tolerelenfosit
edildiği yanıtı
belirtilmiştir
(Garcia et al. 2005;Ide
et al.
2006).
HCV enfeksiyonunda,
HCV proteinleri ile yüklenmiş DH aşılar kullanarak
HCV spesifik hücresel yanıt oluşturulabileceği ileri sürülmektedir
Örneğin;
rHCV core protein ve peptidleri ile yüklenmiş DH’lerle
güçlü bir humoral ve hücresel yanıt elde edilmiş (Encke et al. 2005)
bir diğer çalışmada,
HCV NS3 protein geni taşıyan
adenovirus ile transfekte DH’lerin
farklı fare türlerinde
CD4 Th1 ve CD8 T hücre yanıtı
oluşturulduğu gösterilmiştir (Zabelata et al.2007).
Kronik HBV enfeksiyonunda,
HBsAg-yüklü DH aşısının
sağlıklı gönüllülerde güvenli olduğu,
bazı deneklerde
anti-HBs + oluşturduğu (Akbar 2004).
HBV-HCC
hasta DH’leri
HBcAg ve HBsAg ile yüklendiklerine
HBV
hastalarında
güçlü bir CD40, Kronik
80 ve 86
sentezi
sağladıkları,
HBsAg-yüklü DH aşısının;
T hücre proliferasyon ve IFNg salınışını güçlü bir şekilde
HBV replikasyonunu baskıladığı,
uyardıkları;
serum viral yükü azaltdığı,
HBe-Ag’nin kaybolduğu ve anti-HBe geliştiği (Chen et al. 2005).
DH aşısının HBV HCC hastaları için
yeni bir tedavi
Kronik yöntemi
HBV’de olabileceği
yetersiz DHbildirilmektedir
aktivitesinin, (Shi et al. 2006).
HBcAg ve HBsAg-DH aşısı ile yeniden kazandırılabileceği;
T lenfosit proliferasyon ve antijen spesifik
IFNg üretiminin artırılabildiği bildirilmiştir (Duan et al. 2006).
Akbar ve ark. Journal of Hepatology 2007
• HB aşısına cevapsız 6 hastada HBsAg ve
HBcAg yüklü DH aşılaması ile 28 gün
sonra güçlü serokonverisyon elde edilmiş
DH aşı yönteminin
C.trachomatis
M. tuberculosis
parazit ve mantar enfeksiyon modellerinde
başarılı bir şekilde uygulandığı bildirilmektedir.
Sonuç
DH aşı yönteminin
daha çok kanser alanında potansiyeli araştırılmakta,
yüzlerce çalışma yürütülmektedir.
Diğer taraftan,
DH’lerin enfeksiyon hastalıklarındaki rolünün
daha da iyi anlaşılmasına paralel olarak,
deneysel/klinik şartlarda Ag-yüklü DH aşılarının
özellikle kronik viral enfeksiyonlar için de
hızla değerlendirildiğini görmekteyiz.
100 hastalık AT2 ile inaktive HIV-1 yüklü DH aşılaması ile
ilgili
faz III çalışma 2007 sonunda başlamıştır.
tartışılan
deneysel Kanserde
çalışmalarda
sorun teşkil
DH aşı yöntemi sorunlarının
etmemekle
beraber,
enfeksiyon
hastalıkları
için de
geçerli olduğu düşünülmektedir.
klinik uygulamalar için
en uygun DH kaynağının seçimi,
DH’lerin
en uygun antijenlerin
belirlenmesi ve
uygun
şekilde
DH’lere yüklemesi,
yasal
mevzuat
gereği
antijen yüklü
DH’lerin
en uygun şekilde,
GMP
şartlarında
hangi sayıda ve
hazırlanmış
olmaları
hangi
yoldan gereği de
enjekte edilmesi
unutulmamalıdır.
gibi temel konuların
kapsamlı bir şekilde çalışılmasına ihtiyaç vardır.
2. Hava Kilit koridor
1. Hava Kilit koridor
A
D
B
A
C
C
A
A
G
C
A
D
D
Ziyaretçi koridoru
A sınıf temiz hava
C sınıf temiz hava
B sınıf temiz hava
D sınıf temiz hava