Diagnosticul molecular

Diagnosticul molecular

 Tehnici diagnostice ce urmaresc identificarea unor modificari la nivelul moleculelor de ADN sau ARN: - mutatii - polimorfisme - fragmente exogene - “amprenta ADN” – medicina legala Obiective: Diagnostic pre- si postnatal Diagnostic presimptomatic Identificare heterozigoti Identificare purtatori de premutatii (mutatii dinamice) Metode directe – mutatii cunoscute Metode indirecte – identificarea unor markeri genetici inlantuiti cu alele morbide

Tehnici de baza

 Izolarea ADN genomic  Utilizarea enzimelor de restrictie   Electroforeza (agaroza, PAGE, camp electric pulsatil) Amplificarea “in vitro” prin PCR  Secventarea ADN  Hibridizarea fragmentelor de ADN cu probe specifice marcate

Izolarea ADN genomic – principiu/etape

 Liza celulara  Liza nucleara  Digestia moleculelor de ARN (optional)  Precipitarea proteinelor (inhibitori ai reactiei PCR)  Precipitarea (izolarea) ADN in solutie alcoolica  Spalarea (purificarea) cu alcool 70%   Rehidratare Stocare la congelator >>>>> ∞

Reactia PCR

 Amplificarea fragmentului dorit in miliarde de copii (modelul replicarii ADN “in vivo”) pentru a putea fi ulterior analizat  Necesar reactie PCR ADN –ul tinta (genomic sau fragment de ADN obtinut din amplificare anterioara– nested PCR) Taq-polimeraza Mix dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) Primeri (amorse) specifice, complementare pe cele doua catene (Fw si Rev) MgCl2 Buffer pentru Taq polimeraza Termocycler

Etape PCR

 Denaturarea initiala a ADN – 94-95 grade – 5-10 min.

 Cicluri (30-40) de reactie de amplificare: Denaturare 94-95 grade Legarea amorselor (annealing) – 50-65 grade Elongarea (sinteza) - 72 grade Elongare finala – 72 grade – 5-10 min.

Stocare ampliconi la 4 grade sau congelator pana la prelucrare ulterioara sau direct electroforeza http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/sangerseq.html

apoi Open Hyperlink) (Ctrl Right,

Copies at cycle n = Initial copy #

x

2 n PCR permite obtinerea unei cantitati analizabile, specifica a regiunii determinate de catre amorse Southern si VNTR : 1 µg, PCR si STR : 1 ng

Tehnica PCR-RFLP

 Digestia cu enzime de restrictie a fragmentului amplificat urmata de electroforeza in gel

Metode directe

 Tehn ica RFLP (restriction fragments length polymo rphism) Diagnostic ul mutatiei C282Y in hemocromatoza primara (tip I)

RsaI C282/C282 C282/C282Y C282Y/C282Y 247 pb 140 pb 247 140 111 RsaI RsaI Fragmente amplificate – migrare in gel de agaroza dupa digestie 247 pb 111 pb 29 pb

AS-PCR – amplificare utilizand primeri pt. alela normala, respectiv mutanta

Tehnica Tetra ARMS-PCR

Secventarea automata avand la baza metoda Sanger