Transcript biologie-prednaska10

Metody molekulární biologie
MVDr. Eva BÁRTOVÁ, Ph.D.
Ústav biologie a chorob volně žijících zvířat, FVHE, VFU Brno
Brno 2003
Genomika – studium genomu
1.
Strukturální
- identifikace genů
- umístění genu na chromozomu (fyzické mapování)
- stanovení nukleotidové sekvence genu
2. Komparativní
- mezidruhové srovnávání, evoluční studie
3. Funkční (RNA genomika)
- genová exprese (jak geny fungují)
4. Farmakogenomika
- využití genetiky při vývoji vakcín
Proteomika – studium proteinů
Využití metod molekulární biologie
Teorie
• objev nových genů a proteinů
• zkoumání mechanismu regulace eukaryontních genů
• studium funkce proteinů
• poznání evoluční historie eukar. genu (fylogenetické mapy)
Praxe
• diagnostika původců infekčních onemocnění
• diagnostika genetických chorob (mutace v DNA), léčba
• farmaceutický průmysl – léky (př. inzulín pro diabetiky)
• potravinářství (identifikace přídavků do potravin)
• genové inženýrství (geneticky modifikované organismy)
• soudní lékařství - kriminalistika (identifikace osob)
- testování paternity a maternity
• testování identity jedinců vzácných zvířat
• ověřování rodokmenů zvířat
Metody molekulární biologie
Izolace DNA
Materiál
• tělní tekutiny (krev, plodová voda, sliny)
• tkáně (vlasy, orgány)
• organismy (bakterie, viry, kvasinky, paraziti, rostliny, hmyz)
• čerstvý/zmrazený/parafinovaný materiál
Postup
• komerční kity (enzym - proteáza, pufry, kolonky), izolace 20 min
• fenol chloroformová extrakce
Metody molekulární biologie - klonování
1. Polymerázová řetězová reakce (PCR)
Vytvoření (amplifikace) identických kopií určitého
úseku DNA v přístroji „termocycler“ (K.Mullis, 1983)
Do reakce se dává
•
•
•
•
•
testovaná DNA
synteticky připravené primery (krátké úseky DNA)
nukleotidy ve formě trifosfátů (ATP, TTP, CTP, GTP)
enzym Taq polymeráza (z bakterie Thermus aquaticus)
pufr obsahující Mg2+ ionty
Fáze PCR
•
•
•
denaturace DNA
annealing – nasednutí primerů na komplementární úsek DNA
extension – napojování nukleotidů
Polymerázová řetězová reakce (PCR)
1 cyklus PCR
94 – 95oC
denaturace
50 - 60oC
annealing
72oC
extension
Při 30 cyklech - amplifikace více než 109 kopií úseku DNA
Polymerázová řetězová reakce (PCR)
Typy PCR
• Jednoduchá PCR
• Nested, semi-nested PCR
• Koamplifikační, multiplexová (comultiplex, multiplex PCR)
• Reversní transkripční PCR (RT-PCR)
• Semikvantitativní, kvantitativní PCR
- Komparativní (Q-PCR)
- Kompetitivní (QC-PCR)
- PCR v reálném čase (Real-time Q-PCR)
Metody molekulární biologie - klonování
2. Namnožení úseku DNA v bakteriích
Plazmidový klonovací vektor
- malá kruhová molekula DNA (plazmid bakterie E.coli)
- musí obsahovat replikační počátek
- musí mít místo pro restrikční endonukleázu
- musí mít gen pro rozlišitelnou vlastnost (rezistence k antibiotikům)
Postup
- rozštěpení vektoru restrikční endonukleázou
- začlenění fragmentu DNA do vektoru DNA-ligázou (enzym)
- začlenění plazmidu s fragmentem DNA do bakterie
- po namnožení bakterie, lýza bakterii a uvolnění plazmidů
- vyštěpení fragmentu DNA z plazmidů restrikční endonukleázou
Genomová knihovna (chromozomální DNA)
Genomová
knihovna
Lidská DNA
Fragmenty
genomové DNA
Rozštěpení DNA
restrikční endonukleázou
Rekombinantní
DNA
Inzerce
DNA-fragmentů
do plasmidů
Vnesení
plasmidů
do bakterií
cDNA knihovna (komplementární DNA)
- lýza buněk tkáně a izolace mRNA
- pomoci enzymu reverzní transkriptáza přepis do sekvence DNA
(cDNA= complementary, komplementární DNA)
- naklonování molekul cDNA do plazmidových vektorů
Výhoda: geny v této knihovně jsou bez intronů !!!
Metody molekulární biologie
Gelová elektroforéza
Princip Oddělení fragmentů DNA podle velikosti
Postup
•
•
•
•
příprava gelu – agarózový, polyakrylamidový gel
obarvení vzorku – ethidium bromid, bromfenolova modř
nanesení vzorku na gel - nastavení napětí a doby elektroforézy
zviditelnění fragmentů DNA - UV transluminátor
Příklad výsledku gelové elektroforézy
1-7: pozitivní výsledek - amniové tekutiny gravidních žen (362 bp sekvence)
8: negativní kontrola
9: pozitivní kontrola (362 bp sekvence T. gondii)
10: 50 bp velikostní standart (ladder)
Metody molekulární biologie
PCR/RFLP
restriction fragment length polymorphism
Fáze
• amplifikace specifického úseku DNA pomoci PCR
• štěpení enzymem „restrikční endonukleáza“ při 37oC 1h
• analýza štěpných fragmetů DNA na agarózovém gelu
místo štěpení
5´
HaeIII
3´
RFLP
Restrikční mapy
- fyzická mapa štěpných míst v DNA
- studium polymorfismu mezi druhy, v
rámci druhu mezi kmeny, skupinami
(fingerprinting)
- př. alfa-globinový gen (studium
příbuznosti Ho a ostatních primátů)
Přehodnocování systematického
zařazení jednotlivých organismů
Metody molekulární biologie
Southern blotting
Princip: přenos DNA (jednořetězcové) z gelu na nylonovou nebo
nitrocelulózovou membránu na přístroji „vacuum blotter“
Postup:
• štěpení DNA restrikční endonukleázou
• elektroforéza
• depurinace DNA v HCl, denaturace DNA v NaOH
• Southern blotting (blotování) - pod vakuem 90 min.
(3 vrstvy filtračního papíru, nylonová membrána, gumový rám,
gel s DNA)
- kapilární
Metody molekulární biologie
Hybridizace
Princip: Hybridizace = renaturace (proces obnovení vodíkových
můstků mezi komplementárními bázemi), pomoci DNA
sond se vyhledávají specifické nukleotidové sekvence.
DNA sonda: krátká jednořetězcová DNA (10-1000 nukleotidů),
značena - radioaktivně (izotop 32P)
- neradioaktivně (chemiluminiscence)
Postup:
• uzavření membrány do plastikového sáčku spolu se značenou sondou
• hybridizace (navázání sondy na komplementární úseky DNA)
• vymytí membrány (odstranění nenavázané sondy)
• detekce - autoradigrafie
- detekční látky (hydrogen peroxid a luminol) – fotograf.film
Metody molekulární biologie
Elektroforéza, Southern blotting a hybridizace
neznačená rozštěpená DNA
nitrocel. papír
nitrocelul. papír s DNA
agarózový gel
mycí houba
alkalický roztok
Elektroforéza
Souhthern blotting
Hybridizace
sonda
autoradiograf
Metody molekulární biologie
Stanovení nukleotidové sekvence DNA (sekvenování)
• Enzymová metoda
• Použití přístroje „sekvenátor“
Genová banka NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Kompletní genom (údaje ke konci roku 2003)
Eukaryota: 20 (Avena sativa, Glycine max, Hordeum vulgare, Lycopersicon
esculentum, Oryza sativa, Triticum aestivum, Zea mays, Homo sapiens, Mus
musculus, Rattus norvegicus, Danio rerio, Anopheles gambiae, Arabidopsis thaliana,
Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Encephalitozoon cuniculi,
Guillardia theta, Sacharomyces cerevisiae, Plasmodium falciparum,
Schizosacharomyces pombe)
Prokaryota: 17 (archebakterie), 128 (bakterie)
Viry: 1656
Metody molekulární biologie
Stanovení nukleotidové sekvence DNA (sekvenování)
Genové inženýrství
Využití:
1. Výroba buněčných proteinů ve velkém množství (insulin,
růstový hormon, plášťové proteiny virů pro očkování….)
2. Syntéza velkého množství RNA (studium proteosyntézy)
3. Genová terapie
4. Výzkum nových genů
Transgenní organismy – ve svém genomu obsahují nové geny, nebo
geny pozměněné metodami rekombinantní DNA
Klonování zvířat – 1996 (ovce), 1998 (skot, myš, koza), 2000 (prase,
muflon), 2001 (kočka, divoký tur gaur), 2002 (králík), 2003 (mula,
divoký tur banteng)
(zdroj časopis 21. století/ 8. číslo, www.osel.cz)