Transcript Seminario Maggiore Iacovacci RIS_Roma 12_12_2013 - e

Modulo di Genetica
Forense
Quantificazione del DNA
estratto e determinazione del
sesso genetico
Magg inv sc Giuseppe IACOVACCI
Importanza della quantificazione
Input di DNA “ottimale”
Eccesso di DNA in amplificazione
Difetto di adenilazione
Pull up
Aumento del rumore di fondo
Pull up
Difetto di DNA in amplificazione
In queste condizioni l’analisi risulta affetta da
problemi stocastici (che possiamo ovviare se
aumentiamo il DNA in PCR)
 Se invece è un problema legato alla scarsa
disponibilità di templato dobbiamo interpretare
il dato con un approccio LCN

Normalizzazione
Effettuabile con un liquid handler in automatico sulla
base della quantificazione a meno di misture
Quantificazione del DNA estratto
•DOT-BLOT
•ELETTROFORESI GEL AGAROSIO
•LA SPETTROFOTOMETRIA “UV”
• LA FLUORIMETRIA
Plexor® HY Amplification Targets
4-color, triplex Plexor® qPCR assay

Autosomal – fluorescein
◦ 99bp multicopy target (RNU2) on chromosome 17
◦ repeated motif ~6kb
◦ Locus is conserved in primates

Y – Cal Orange 560
◦ 133bp multicopy target (TSPY/DYZ5) on short arm
◦ repeat motif ~20kb
◦ Locus is conserved in primates

IPC – Cal Red 610
◦ 150bp, novel target

Normalizzatore di fluorescenza

Multicopy targets
◦ Increased sensitivity and reduced impact of primer site mutation
◦ Autosomal and Y have similar copy number
This quality sensor is designed to
be less stable than the 4NS1C
target, showing a shift (mostly not a
complete failure) of the CT value in
the presence of inhibitors.
The 4NS1C target is a multicopy
target
which
was
validated in an external study.
It is represented by about 20
copies per haploid genome and
is
located
on
different
autosomal chromosomes.
Il mio parere
Perché utilizzare la PCR quantitativa???
 Visto che le nostre analisi son end-point!
 E se sviluppassimo un sistema a due colori
(cromaticamente adiacenti) con ampliconi da 100 a 600 bp
(possiamo alloggiare 7-9 marcatori STR) che coamplifica
un target sensibile agli inibitori come IPC (o magari due
uno per i bassi pesi molecolari e uno per alti pesi
molecolari per vedere la tenuta dell’enzima) su un terzo
colore
 Avremo un sistema di screening da poter utilizzare per
normalizzare prima del megaplex che gira sul sequenziatore
(ma forse qualcuno deve vendere le real-time!!!!?)

Determinazione del sesso genetico
sulle tracce
AmpFLP
Y specifici
RFLP con sonde Y specifiche
Il sistema amelogenina



Locus per la determinazione genetica del sesso
La determinazione del sesso di pertinenza del materiale genetico estratto è
stata condotta mediante lo studio del dimorfismo sessuale associato al locus
per il gene della Amelogenina (Sullivan KM et al 1993). Questo gene codifica
per la principale proteina della matrice extracellulare implicata
nell’osteogenesi della gemma dentale. Questo locus è presente tanto sul
cromosoma X in posizione p22.1-22.3 che sul cromosoma Y in posizione
p11.2 (quello sull’Y è uno pseudogene) e l’amplificato ottenuto dai due
cromosomi presenta una differenza di lunghezza, in particolare il frammento
prodotto dal cromosoma X è lungo 213 bp mentre quello del cromosoma Y è
lungo 219 bp. (i primer originali producevano ampliconi di 106-112)
Ma in alcuni mammiferi dentati questi stessi primer producevano un
frammento specifico di 103 bp
Il sistema amelogenina
Il sistema amelogenina
Power plex 16HS
Identifiler
NGM
ESX 17
Il sistema amelogenina
Le regole in biologia ammettono eccezioni
Ma comunque una volta che
conosciamo l’eccezione!
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