Transcript LACZIK_gyogyszeresz - 6. szeminarium

IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA,
SZEROLÓGIAI REAKCIÓK
(PRECIPITÁCIÓ)
IMMUNKOMPLEX
Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott szolubilis komplexei.
A komplexképződés pillanatszerűen is lejátszódhat, egyensúlyra vezető folyamat.
Nem azonos a precipitátummal!
A precipitátum az immunkomplexekből fizikai-kémiai folyamatok során
keletkező oldhatatlan csapadékot jelenti. Időigényes folyamat.
Precipitációs görbe
antigéntúlsúly
EKVIVALENCIA
ellenanyagtúlsúly
sok
csapadék
kevés
csapadék
növekvő ellenanyag mennyiség
Ekvivalenciát befolyásoló tényezők:
-valencia
-pH
IgA-dimer
IgM-pentamer
-hőmérséklet
(pl., hideg agglutininek /IgM antitestek/ 4 °C,és meleg agglutininek
/IgG antitestek/ 37 °C által mediált autoimmun hemolítikus anémiák)
- sókoncentráció
- idő (antigén-antitest kötődés pillanat alatt, míg a precipitátumhoz több óra kell)
- egyéb (pl. PEG) – az oldékonyságot csökkenti
MÓDSZEREK
Immundiffúzió:
- radiális egyszerű (Mancini)
- radiális kettős (Ouchterlony)
Elektroforézis:
- immunoelektroforézis
- rakéta elektroforézis
- két-dimenziós elektroforézis
- izoelektromos fókuszálás és immunofixálás
Nefelometria (fény csökkenés mérése)
Turbidimetria (fényszórás mérése)
Antigén koncentráció
Antigén koncentráció meghatározása radiális immundiffúzióval
Antigént tartalmazó lyuktól való távolság
Precipitációs gyűrű
Radiális immundiffúzió: az antigén koncentráció és
a precipitációs gyűrű méretének kapcsolata. A nagyobb
koncentrációjú antigén (Ag1) a lyuktól messzebbre
vándorolva éri el azt az egyensúlyi állapotot, ahol a
megfelelő ellenanyag-mennyiséggel precipitátumot
képez.
IgG koncentráció (mg/ml)
Az optimális
arányt adó
antigén
koncentráció.
A gyűrű átmérője
IgG koncentráció mérése stérumból radiális
immundiffúzióval.
A standardok átmérője lehetővé teszi a kalibrációs görbe
megrajzolását.
A vizsgált szérum minta IgG koncentrációja a görbéről
leolvasható:
- T1 – IgG mielómás beteg szérumából; 15 mg/ml
- T2 – hipogammaglobulinémiás beteg széruma; 2,6 mg/ml
- T3 – normál szérum; 9,6 mg/ml
A precipitációs gyűrű átmérője
Bakteriális extra-intracelluláris
enzimek, anyagcseretermékek
Pl., koaguláz termelés (S. aureus)
Ag koncentráció
Radiális kettős immundiffúzió
„Rakéta elektroforézis”
Elektroimmunodiffúzió (Laurell)
A rakéta alakú precipitációs csúcsok magassága arányos az antigén
koncentrációjával
koagulációs faktorok kimutatása (pl., vWF, trombin aktivitás)
Immunelektroforézis
Immunprecipitáció
Az antigén-ellenanyag kapcsolódást követően képződő
oldott immunkomplexeket szilárd fázishoz kötött antiimmunglobulin vagy protein A/G bakteriális fehérjék
segítségével oldhatatlan formában izolálják. A szilárd
fázishoz kötött immunkomplexek további elúciós lépések
eredményeként, oldott állapotban visszanyerhetők.
Gammopátiák diagnosztikája: M komponens kimutatása
zónaelektroforézis és immunoelektroforézis segítségével
Szerológiai módszerek alkalmazása
Immundiffúzió: pl: bakteriális, virális és gomba antigének jellemzésére
- radiális egyszerű (Mancini-módszer): antigének
mennyiségének
összehasonlító vizsgálata, szérum fehérjék ( immunoglobulin izotípusok [IgM, IgG, IgA], akut
fázis fehérjék, transzferrin, komplement komponensek) mennyiségi meghatározása
különböző testfolyadékokban, ellenanyagok mennyiségi meghatározása
- radiális kettős (Ouchterlony módszer): precipitációs ekvivalencia zóna
becslése, precipitáló ellenanyagok relatív szintjének (titerének) meghatározása, állandó
ellenanyag koncentráció mellett az antigén mennyisége is megbecsülhető
Elektroforézis:
- immunoelektroforézis: szérum fehérjék frakciókra való elválasztása,
plazmasejt diszkráziák (mielóma multiplex, Waldenström makroglobulinémia, elsődleges
amiloidózis) során képződő, monoklonális eredetű immunoglobulinok kimutatása
- rakéta elektroforézis: antigén/ellenanyag koncentráció meghatározása
- két-dimenziós elektroforézis: elektroforetikus
mobilitás
alapján
szétválasztott frakciók (pl: szérum fehérjék) koncentrációjának meghatározása, szérum,
vizelet, cerebrospinális folyadék fehérjeösszetételének kvantitatív és kvalitatív vizsgálata
Turbidimetria: (érzékenység: 50 µg/ml)
szérumban, liquorban nagy mennyiségben
jelen lévő fehérjék vizsgálata
Nefelometria: (érzékenység: 1 µg/ml)
gyógyszer szintek mérése
kis koncentrációjú szérum és liquor fehérjék,
Az in vivo képződő immunkomplexek eltávolításának mechanizmusai
blokkolás
Y
precipitálás
oldás
oldható komlexek
kimutatása
C1q
C1r, C1s (aktív enzim)
C4, C2
VVT
CR1
C3a
gyulladás
C3
C5,6,7,8,9
C3b
FcR
Makrofág
CR3
lízis
•fizikai méret
•ppt (PEG, stb.)
•Anti-Ig
•Anti-C3
•C1q kötés
•sejthez kötődés
•C3 receptor
•Fc receptor
memória B-sejtek
fagocitózis
citotoxicitás
Agglutináció típusai, gyakorlati alkalmazás
A vörös- és fehérvérsejtek valamint baktériumok sejtfelszíni antigénjeivel
(legalább mikroszkópikus méretű antigének) reagáló ellenanyagok a sejtek
összeállását, agglutinációját idézhetik elő.
Fajtái:
• direkt: Ellenanyagok kötődését az antigénhez a sejtek összecsapódása
kíséri (pl. AB0 vércsoport antigének) - főleg IgM
• indirekt : Az antigén determinánsok elrendeződése nem teszi lehetővé az
direkt összecsapódást.
DE! A sejtek összecsapódása a kötött ellenanyagok Fc részéhez
kötődő második ellenanyaggal kiváltható (pl. D vércsoport antigén(Rh))
(IgG)
• passzív: Megfelelően kezelt vörösvértestekhez vagy latex részecskékhez
haptének vagy antigének kapcsolhatók, és ezekre specifikus
ellenanyaggal agglutinálhatók (rheumatiod arthritis).
A szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM és IgG autoellenanyagok (RF)
jelennek meg.
- reakció
+ reakció
- reakció
gyors
ülepedés
lassú
ülepedés
gyors
ülepedés
Direkt agglutináció
IgM
antitest
pl. AB0 vércsoport meghatározás
vörösvértest
Az ABO vércsoportantigének szerkezete
O ANTIGÉN
A ANTIGÉN
B ANTIGÉN
SZÉNHIDRÁT TÍPUSÚ ANTIGÉNEK
A fenotípusok kialakulását kodominánsan öröklődő specifikus enzimek irányítják.
Donorválasztás az ABO-vércsoport antigének alapján
Ma már csak elvi lehetőség, rutinban kizárólag csoportazonos (AB0 és Rh) vér transzfundálható!
-
+
+
+
-
-
+
+
-
+
-
+
-
-
-
-
Vércsoport meghatározás
Ágy melletti gyorsteszt
Hagyományos csempés meghatározás
Microplate-s meghatározás
Gélkártyás technika
Indirekt agglutináció
vörösvértest
IgG
szekunder
ellenanyag
(antitest)
pl. Rh vércsoport meghatározás
A Rhesus (Rh) vércsoportantigén (D)
FEHÉRJE ANTIGÉN
A VÖRÖSVÉRTESTEKEN
D antigén
extracelluláris tér
citoplazmamembrán
intracelluláris tér
Anti-D antitest
IgG típusú ellenanyag
direkt agglutinációt nem vált ki (inkomplett ellenanyag),
de emberi immunglobulinokkal reagáló
2. ellenanyaggal az agglutináció kiváltható
indirekt agglutináció
Az agglutináció in vivo következményei
ABO inkompatibilitás
intravascularis haemolysis
(komplement mediálta hemolízis)
Rh inkompatibilitás
erythroblastosis fetalis
(vvt-ek opszonizálása, majd MF –ok,
granulociták általi fagocitózis)
Rh profilaxis
Ha az első Rh+ magzat születését követően
72 órán belül az anyai szervezetbe anti-D Ea-t
juttatnak, megelőzhető az anyai ellenanyagok
képződése.
Passzív agglutináció
(diagnosztikai/indikátor módszer)
Rheumatoid arthiritis: a szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM autoellenanyagok
(RF = reuma faktor) jelennek meg.
Humán immunglobulin antigéneket fixálva latex gyöngyök / vvt-k felszínére és ezeket
az RA-s beteg szérumával reagáltatva agglutináció következik be, ha a szérumban RF
van jelen.
Hemagglutináció ellenanyagok jelenléte nélkül?
(Nem immunológiai reakció!!!)
Igen, virális fehérjékkel
pl.: influenza, mumpsz
pl. vírus ellenes ellenanyagok kimutatása
Az agglutinációt gátló ellenanyagok a receptor kötést (sziálsav) is gátolják,
tehát vírusneutralizáló sajátságúak
Gyakorlati alkalmazás
direkt agglutináció:
ABO vércsoport meghatározás
Widal-teszt: tiphoid láz, febris undulans
indirekt agglutináció:
anti-D Ea jelenlétének kimutatása
direkt Coombs-teszt:
vércsop. inkompatibilitás,
autoimmun hemolitikus anémia
indirekt Coombs-teszt:
transzfúzió előtt, terhesség alatt
passzív agglutináció:
rheuma faktor kimutatása
terhességi monoteszt