Transcript áramlási citometria, precipitáció, agglutináció

9. szeminárium
ÁRAMLÁSI CITOMETRIA
IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA,
SZEROLÓGIAI REAKCIÓK
AGGLUTINÁCIÓ, PRECIPITÁCIÓ
(Az Ag-Ea kölcsönhatást követő másodlagos szerológiai reakciók)
ÁRAMLÁSI CITOMETRIA
A fluoreszcens mikroszkópiához hasonlóan az
immunofluoreszcenciai
módszerek
eszköztárába
tartozik, használatuk kiegészíti egymást
• Folyékony közegben, nagy sebességgel áramló egyedi sejteket,
partikulumokat vizsgál
• A fluoreszcens festékkel jelölt sejtek által kibocsátott fény
intenzitását és a sejtek fényszórását detektálja
• Rendkívül nagy számú sejt egyedi vizsgálatára alkalmas
(akár több millió sejt percek alatt)
AZ ÁRAMLÁSI CITOMETRIA MINT AZ IMMUNRENDSZER
VIZSGÁLATÁNAK ADEKVÁT ESZKÖZE
Az immunrendszer sejtjeinek többsége nem vagy csak lazán kötött formában található,
könnyen sejtszuszpenzióba vihető, fluoreszcens antigén specifikus ellenanyagokkal jelölhető és
sejtenként vizsgálható.
A nagyszámú sejt fényszórási és immunfluoreszcens sajátságai statisztikailag értékelhetők. (pl.
sejtpopulációk százalékos aránya)
Kis százalékban jelenlevő sejttípusok vizsgálatára is alkalmas (pl. adott antigénre specifikus
limfociták, ritka sejtpopulációk vizsgálata)
Az immunfluoreszcens jellemzők nem csak kvalitatív, hanem kvantitatív eredményekkel is
szolgálhatnak – nem csak egy antigén jelenlétére, hanem annak mennyiségére és így egyes
kezelések utáni mennyiségi változására is következtethetünk belőle. (pl. sejtaktivációt kísérő
változások, betegségek progressziójának nyomon követése)
CD antigén
sejttípus
funkció
ligand
CD3
T sejtek
T sejt antigén receptor jelátvivő
része
(Intracelluláris
kináz, foszfatáz)
CD4
helper T sejtek, (monociták, pDC)
T sejt antigénreceptor
koreceptora, (HIV receptor)
MHC- II, HIV
CD5
T sejtek, (B sejt alpopuláció: B1)
sejt adhézió, jelátvitel
(kostimuláció)
CD72
CD8
citotoxikus T sejtek, (NK,  T sejt
alpopuláció)
T sejt antigénreceptor
koreceptora
MHC I
CD14
Monociták, makrofágok, granulociták egy
része
LPS receptor része
LPS, LBP
CD19
B sejtek
A CR2-vel (CD21) és a CD81 gyel együtt a B sejt
antigénreceptor koreceptor
komplexe
C3d, iC3b  CD21
a felismerő rész
CD28
T sejtek
kostimuláció
(B7-1, B7-2)
CD80, CD86
CD34
hematopoietikus progenitor sejt
(endotheliális sejtek)
sejt adhézió
CD62L
(L-szelektin)
CD56
NK sejtek, (T és B sejt alpopuláció)
homoadhézió (N-CAM izoform)
professzionális APC: DC, B, monocita,
makrofág
kostimuláció, sejt adhézió
CD80, CD86 (B7-1,
-2)
CD28, CD152
Az áramlási és az optikai rendszer elvi
fotoelektronfelépítése
sokszorozó csövek
sávszűrők
PMT 4
dikroikus
tükrök
minta
PMT 3
áramlási
cella
PMT 2
(PMT = photon multiplayer tube)
FSC detektor
fotodióda
PMT 1
Laser
Többféle fluoreszcens szín, és a megvilágító fényforrás sejteken szóródó fénye is mérhető.
Fel lehet fogni fluoreszcens mikroszkópként ami alatt áramlik a minta – de nincs képalkotása, csak
fényintenzitás mérés.
AZ IMMUNRENDSZER SEJTJEINEK JELLEMZÉSE SEJTFELSZÍNI
ANTIGÉNEK ALAPJÁN
Az egyes sejttípusoknak jellemző sejtfelszíni antigén „mintázata” van.
Diagnosztikus értékű lehet:
- a sejttípusok jellemző százalékos arányának megváltozása
- rendellenes sejtfelszíni markerek megjelenése
- egyes markerek mennyiségének megváltozása, eltűnése
Példák:
- gyulladásos folyamatok – neutrofil granulociták számának
növekedése
- HIV progresszió, AIDS manifesztáció – CD4+ helper T-sejtek
számának csökkenése
CD4+ : CD8+ = 1.6
Normál CD4+ T-sejt szám = 600 – 1400/l
HIV fertőzés  AIDS = CD4+ T-sejt szám <200/l
(arány „átfordul”)
- CD5+ B-sejtek felszaporodása – B-sejtes leukémiák egy része
Az immunválaszra gátló hatást kifejtő mikroorganizmusok egy része a limfocitákat fertőzi.
A HIV (Human Immunodeficiency Virus) ijesztő példája annak, hogy milyen
következményekkel jár, ha az immunsejteket egy mikroorganizmus megfertőzi és elpusztítja.
A HIV receptora a T-sejtek felszínén lévő CD4 molekula. A CD4 molekula a makrofág típusú
sejtek felszínén is expresszálódik, így a vírus ezeket a sejteket is
képes megfertőzni.
A klinikai lappangás ideje hosszú,
általában több év.
Ezalatt mind a CD4+ sejtek, mind a
vírusrészecskék gyorsan pusztulnak és
újratermelődnek. Amikor a CD4+ sejtek
nagyobb arányban pusztulnak el, mint
ahogy a szervezet képes lenne
regenerálni őket, számuk olyan
alacsony értéket vesz fel, hogy
a sejtközvetített immunitás
működésképtelenné válik.
A sejtközvetített immunválasz
hiányában a gazdaszervezet
halálos kimenetelű opportunista
fertőzések áldozatául eshet.
A mérés elve egy példán keresztül:
A CD4+ (helper) és a CD8+ (citotoxikus) T-sejtek arányának
Meghatározása perifériás vérben (pl. AIDS progresszió nyomon követése)
Jelölő anyagok:
FITC jelzéssel ellátott anti-CD4 ellenanyag (α-CD4-FITC)
PE jelzéssel ellátott anti-CD8 ellenanyag (α-CD8-PE)
Th
NK
Tc
A perifériás vérben jelenlévő fő limfocita populációk
Fluoreszcens
mikroszkóppal valami
ilyesmit látnánk
B
Th
nagy sebességű folyadékáram
A CD4-FITC jelölt (TH) sejt
detektálása
(küvettában, vagy szabadon)
detektor
jelfeldolgozó
egység
CD8
PE
Képernyő
növekvő
fényintenzitás
A CD4+ CD8- sejtet
szimbolizáló pont
CD4
FITC
mikroszkóppal:
Tc
A CD8-PE jelölt (Tc) sejt
detektálása
CD8
PE
detektor
jelfeldolgozó
egység
növekvő
fényintenzitás
CD4
FITC
B
A jelöletlenül maradt sejtek
detektálása (pl.B-sejtek)
CD8
PE
detektor
jelfeldolgozó
egység
növekvő
fényintenzitás
mikroszkóppal
halványnak látszó
(autofluoreszcens) sejt
CD4
FITC
CD8
PE
18%
44%
0%
kvadráns
statisztika
CD4 38%
FITC
ÁBRÁZOLÁSMÓDOK
Hisztogramm
dot-plot
contourplot
densityplot
Az intenzitás értékek
számszerűsíthetőek:
~ 1300
(Homogén sejtpopuláció
hisztogrammja a normál
eloszlásnak megfelelő)
A KÜLÖNBÖZŐ SEJTTÍPUSOKNAK JELLEGZETES FÉNYSZÓRÁSUK VAN
granulociták
oldal irányú fényszórás
(SSC)
(pl.granuláltság)
monociták
limfociták
előre irányuló
fényszórás (FSC)
(„méret”)
AZ IMMUNOESSZÉK ÉRZÉKENYSÉGE
Az ismertetésre kerülő módszerek
egyszerűek, olcsók, kis műszerezettségi
igényűek,
de többségük csak szemikvantitatív
eredményekkel szolgál és bizonyos célokhoz
nem kellően érzékeny
PRECIPITÁCIÓS MÓDSZEREK
Antigének vagy antitestek mennyiségi és/vagy
minőségi meghatározása
Szérumból, CSF-ból, vizeletből
IMMUNKOMPLEX
Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott (oldható) komplexei.
A komplexképződés pillanatszerűen is lejátszódhat, egyensúlyra vezető folyamat.
Nem azonos a precipitátummal!
A precipitátum az immunkomplexekből fizikai-kémiai folyamatok során keletkező oldhatatlan
csapadékot jelenti. Időigényes folyamat.
PRECIPITÁCIÓS GÖRBE
sok
csapadék
ellenanyagtúlsúly
EKVIVALENCIA
antigéntúlsúly
kevés
csapadék
növekvő antigén mennyiség
sok
csapadék
antigéntúlsúly
ellenanyagtúlsúly
kevés
csapadék
növekvő ellenanyag mennyiség
EKVIVALENCIÁT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZŐK
- valencia
(kapcsolatteremtő képesség)
- hőmérséklet
(37оC ; 4 оC )
- pH
- sókoncentráció
IgM-pentamer
- idő
- egyéb (pl. PEG)
Oldékonyságot csökkenti, kedvez a
csapadék-képződésnek
IgA-dimer
PRECIPITÁCIÓS MÓDSZEREK
• Immundiffúzió: immunprecipitáció lágy gélközegben
• radiális egyszerű (Mancini-módszer)
• radiális kettős (Ouchterlony-módszer)
• Elektroforézis:
• immunoelektroforézis (többkomponensű antigént elektroforetizálják, majd polivalens
ellenszérummal reagáltatják)
• két-dimenziós elektroforézis (elektroforetikus tulajdonságok alapján szétválasztott antigén
frakciókat ellenanyag tartalmú gélen újra elektroforetizálják)
• Turbidimetria (a fényszórással arányos
fényintenzitás-csökkenést méri)
szérum- és liquorfehérjék mennyiségi meghatározása 50 µg/ml-ig
• Nefelometria (a szórt fény intenzitását méri)
szérum- és liquorfehérjék, gyógyszerszintek mennyiségi meghatározása
1 µg/ml-ig
IMMUNDIFFÚZIÓS MÓDSZEREK
Mancini módszer
Pl. vírus antigének / vírus specifikus
ellenanyagok mennyiségi
meghatározása
Ouchterlony módszer
Extrahálható nukleáris
antigén (ENA) specifikus
antitestek kimutatása
(ENA: pl. Ro, La, Sm, RNP,
Scl-70, Jo1)
La
Sm
Ro
Jo1
RNP
Tesztelendő szérum
Scl-70
ANTIGÉN KONCENTRÁCIÓ MEGHATÁROZÁSA RADIÁLIS IMMUNDIFFÚZIÓVAL
Ag koncentráció
IgG koncentráció (mg/ml)
A gyűrű átmérője
Ea a gélben
A gyűrű átmérője
Radiális immundiffúzió: az antigén koncentráció és a
precipitációs gyűrű méretének kapcsolata. A nagyobb
koncentrációjú antigén a lyuktól messzebbre vándorolva
éri el azt az egyensúlyi állapotot, ahol a megfelelő
ellenanyag-mennyiséggel precipitátumot képez.
IgG koncentráció mérése szérumból radiális immundiffúzióval.
A standardok átmérője lehetővé teszi a kalibrációs görbe megrajzolását.
A vizsgált szérum minta IgG koncentrációja a görbéről leolvasható:
- T1 – IgG mielómás beteg szérumából; 15 mg/ml
- T2 – hipogammaglobulinémiás beteg széruma; 2,6 mg/ml
- T3 – normál szérum; 9,6 mg/ml
IMMUNELEKTROFORÉZIS
+
-
szérum fehérjék
frakciókra való
elválasztása,
plazmasejt diszkráziák
(mielóma multiplex,
Waldenström
makroglobulinémia,
elsődleges
amiloidózis) során
képződő,
monoklonális eredetű
immunoglobulinok
kimutatása
AGGLUTINÁCIÓ
AGGLUTINÁCIÓ TÍPUSAI, GYAKORLATI ALKALMAZÁS
A vörös- és fehérvérsejtek valamint baktériumok sejtfelszíni antigénjeivel (legalább
mikroszkópikus méretű antigének) reagáló ellenanyagok a sejtek összeállását, agglutinációját
idézhetik elő.
Fajtái:
• direkt:
Ellenanyagok kötődését az antigénhez a sejtek
összecsapódása kíséri
(pl. AB0 vércsoport antigének) - főleg IgM
• indirekt :
Az antigén determinánsok elrendeződése nem teszi lehetővé a
direkt összecsapódást. DE! A sejtek összecsapódása a kötött
ellenanyagok Fc részéhez kötődő második ellenanyaggal
kiváltható
(pl. D vércsoport antigén (Rh)) - főleg IgG
• passzív:
Megfelelően kezelt vörösvértestekhez vagy latex részecskékhez
haptének vagy antigének kapcsolhatók, és ezekre specifikus
ellenanyaggal agglutinálhatók
rheumatiod arthritis: A szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM
és IgG autoellenanyagok (RF= rheuma faktor) jelennek meg.
- reakció
gyors
ülepedés
+ reakció
lassú
ülepedés
- reakció
gyors
ülepedés
DIREKT AGGLUTINÁCIÓ
vörösvértest
pl. AB0 vércsoport meghatározás
AZ ABO VÉRCSOPORTANTIGÉNEK SZERKEZETE
O ANTIGÉN
A ANTIGÉN
B ANTIGÉN
A fenotípusok kialakulását kodominánsan öröklődő specifikus enzimek irányítják.
Donorválasztás az ABO-vércsoport antigének alapján
Ma már csak elvi lehetőség, rutinban kizárólag csoportazonos (AB0 és Rh)
vér transzfundálható!
KVANTITATÍV HEMAGGLUTINÁCIÓS TESZT
Agglutinációra képes anyagok (antitestek, vírusok)
mennyiségének meghatározása
antitest titer – az a legnagyobb hígítás ahol még van agglutináció
INDIREKT AGGLUTINÁCIÓ
pl. Rh vércsoport meghatározás
primer ellenanyag
szekunder ellenanyag
A RHESUS (Rh) VÉRCSOPORTANTIGÉN (D)
FEHÉRJE ANTIGÉN
extracelluláris tér
citoplazmamembrán
intracelluláris tér
IgG típusú ellenanyag
direkt agglutinációt nem vált ki (inkomplett ellenanyag),
de emberi immunglobulinokkal reagáló
2. ellenanyaggal az agglutináció kiváltható
indirekt agglutináció
AZ AGGLUTINÁCIÓ IN VIVO KÖVETKEZMÉNYEI
ABO inkompatibilitás
intravaszkuláris hemolízis
(komplement mediált hemolízis)
Rh inkompatibilitás
erythroblastosis fetalis
(magzati vv.sejtek opszonizálása,
komplement aktiváció, MF-ok,
granulociták általi fagocitózis)
Rh profilaxis
Ha az első Rh+ magzat születését
(vetélését) követően 72 órán belül az
anyai szervezetbe anti-D Ea-t
juttatnak, megelőzhető az anyai
ellenanyagok képződése.
PASSZÍV AGGLUTINÁCIÓ
(diagnosztikai/indikátor módszer)
Rheumatoid arthiritis: a szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM autoellenanyagok
(RF = reuma faktor) jelennek meg.
Humán immunglobulin antigéneket fixálva latex gyöngyök / vvt-k felszínére és ezeket
az RA-s beteg szérumával reagáltatva agglutináció következik be, ha a szérumban RF
van jelen.
PASSZÍV HEMAGGLUTINÁCIÓ GÁTLÁSA OLDOTT AG-NEL
Tudománytörténeti érdekesség
Oldott haptén vagy Ag gátolja az agglutinációt.
pl. Monoteszt terhességi teszt: vvt-k felszínéhez hCG-t kapcsolnak és hormon specifikus
ellenanyaggal váltják ki az agglutinációt.
Ha ehhez a rendszerhez terhes nő vizeletét adjuk (oldott hCG!), akkor gátoljuk az
agglutinációt.
HEMAGGLUTINÁCIÓ ELLENANYAGOK JELENLÉTE NÉLKÜL?
(Nem immunológiai reakció!!!)
Igen, virális fehérjékkel
pl.: influenza, mumpsz
pl. vírus ellenes ellenanyagok kimutatása
Az agglutinációt gátló ellenanyagok a receptor kötést (sziálsav) is gátolják,
tehát vírusneutralizáló sajátságúak
GYAKORLATI ALKALMAZÁS
direkt agglutináció:
ABO vércsoport meghatározás
Widal-teszt: tiphoid láz, febris undulans
indirekt agglutináció:
Rh vércsoport meghatározás
direkt Coombs-teszt:
vércsop. inkompatibilitás,
autoimmun hemolitikus anémia
indirekt Coombs-teszt:
transzfúzió előtt, terhességalatt
passzív agglutináció:
rheuma faktor kimutatása
terhességi monoteszt