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Biologie Moléculaire
Compétences Techniques
Compétences
Micropipetage
Préparation
de solutions
Travailler avec les concentrations
Dilutions
Quantités
Électrophorèse sur gel d’agarose
Micropipetage- Mesurer de
petits volumes
Permet
1
la mesure de microlitres (µL)
000 X moins que 1 millilitre
2-20 µL
Max. 0.02 mL
50-200 µL
0.2mL
100-1000 µL
1mL
Réglage du volume- P20
Dizaines (0, 1=10 or 2=20)
Unités (0-9)
Décimale (1-9 = 0.1-0.9)
Réglage du volume- P200
Centaines (0, 1=100 ou 2=200)
Dizaines (0, 1-9=10-90)
Unités (1-9)
Réglage du volume - P1000
Milliers (0, 1=1000)
Centaines (0, 1-9=100-900)
Dizaines (0, 1-9=10 - 90)
Utilisation du micropipetteur
Étape 1
Insérer embout
Étape 2
Peser piston
jusqu’au
Premier arrêt
Étape 3
Insérer embout dans la
solution a être prise
Étape 4
Aspirer l’échantillon en
relâchant lentement le piston
Étape 5
Retirer pipetteur
Livraison
Commencer à livrer
1er arrêt =livrer
2e arrêt = expulsion
Directives pour reproductibilité
optimale
Utiliser
le pipetteur dont le volume se
rapproche le plus de celui désiré
VITESSE et FORCE consistante pour peser et
relâcher le PISTON
PROFONDEUR D’IMMERSION consistante
3-4mm
EVITER
sous la surface
les bulles d’airs
Ne jamais aller au-delà des limites du pipetteur
Préparation des
Solutions
Définitions
Solution
Mélange
de 2 substances ou plus dans une
phase unique
Solution composée de deux composantes
Soluté
– Partie qui est dissoute ou diluée – Habituellement la
plus petite quantité
Solvant
(OU Diluent)
– Partie de la solution dans laquelle le soluté est
dissout – Habituellement le plus grand volume
Concentrations
Concentration = Quantité de soluté
Quantité de solution (Pas solvant)
Façons d’exprimer les concentrations:
Concentration Molaire (Molarité)
Pourcentages
Masse par volume
Rapports
Molarité
No
de Moles de soluté/Litre de solution
Masse
de soluté/PM de soluté = Moles de soluté
Moles
de soluté/vol en L de solution = Molarité
Pourcentages
Les
concentrations en pourcentage
peuvent être exprimé en tant que :
V/V
– volume de soluté/100 mL de solution
M/M – Masse de soluté/ 100g de solution
M/V – Masse de soluté/100 mL de solution
Tous
représentent des fractions de 100
Pourcentages
(suite)
%V/V
Ex.
4.1L soluté/55L solution =7.5%
Doit
avoir les mêmes unités en haut et en bas!
%M/V
Ex.
16g soluté/50mL solution =32%
Dois
avoir des unités du même ordre de
grandeur en haut et en bas!
%
M/M
Ex.
1.7g soluté/35g solution =4.9%
Dois
avoir les mêmes unités en haut et en bas!
Les Dilutions
Réduire une Concentration
Une Fraction
Dilutions
Dilution
= produire des solutions plus
faibles à partir de solutions plus fortes
Exemple : Faire du jus d’orange à
partir de concentré. Mélanger une
cannette de concentré de jus d’orange
congelé avec trois (3) cannettes d’eau
Dilutions
Les
(suite)
dilutions sont exprimées comme le
volume de la solution étant diluée par le
volume total final de la dilution
Dans l’exemple du jus d’orange, la dilution
serait exprimée comme 1/4, pour une
cannette de jus à un TOTAL de quatre
cannettes de jus dilué. Quand on parle de
la dilution, vous diriez pour l’exemple du
jus : « un dans quatre ».
Dilutions
Un
(suite)
autre exemple :
Si vous diluez 1 ml de sérum avec 9 ml
de salin, la dilution serait écrite 1/10 ou
dite « un dans dix », car vous exprimez
le volume de la solution étant diluée (1
ml de sérum) par le volume final TOTAL
de la dilution (10 ml totaux).
Dilutions
Un
(suite)
autre exemple :
Une (1) partie d’acide concentré est
diluée avec 100 parties d’eau. Le
volume total de solution est 101 parties
(1 partie d’acide + 100 parties d’eau).
La dilution est écrite comme 1/101 ou
dite “un dans cent un ”.
Dilutions
(suite)
Remarquez
que les dilutions n’ont pas
d’unités (cannettes, ml, ou parties) mais
sont plutôt exprimées comme un
nombre par rapport à un autre nombre
Exemple
: 1/10 ou « un dans dix»
Dilutions
Les
(suite)
dilutions sont toujours exprimées
avec la substance originale étant diluée
comme étant un (1). Si plus d’une
partie de la substance originale est
initialement utilisée, il est nécessaire de
convertir la partie de la substance
originale à un (1) quand la dilution est
exprimée.
Dilutions (suite)
Exemple:
Deux (2) parties d’un colorant sont diluées avec huit (8)
parties de diluant. Le volume total de solution est 10
parties (2 parties de colorant + 8 parties de diluent). La
dilution est initialement exprimée comme 2/10, mais la
substance originale doit être exprimée comme étant un (1).
Pour convertir le volume original à un (1), utiliser une
équation de rapport et de proportion. Rappelez-vous que les
dilutions sont exprimées en terme de 1 à quelque chose :
__2 parties de colorant
=
___1.0___
Volume total de 10 parties
x
2x
=
10
x
=
5
La dilution est exprimée comme étant 1/5.
Dilutions (suite)
La dilution n’est pas toujours représentée par des nombres
entiers.
Exemple:
Deux parties (2) de sang sont diluées avec cinq (5) parties
de saline. Le volume total de solution est sept (7) parties (2
parties de sang + 5 parties de saline). La dilution serait
2/7, ou plus précisément 1/3.5. Encore une fois, ceci est
calculé en utilisant une équation de rapports et de
proportions. Rappelez-vous que les dilutions sont exprimées
en terme de 1 à quelque chose:
__2 parties de sang_____
=
___1.0___
Volume total de 7 parties
x
2x
=
7
x
=
3.5
La dilution est exprimée comme 1/3.5
Qu’est que cela veut dire??
Si
une solution possède une dilution de 1/10
le nombre représente 1 partie de
l’échantillon ajouté à 9 parties de diluant.
Si cette solution était préparée à un volume
final de 110 mL, quels volumes de soluté et
de solvant doivent être utilisés?
Ceci représente 1 partie d’échantillon
ajoutée à 9 parties de diluant.
En autres mots, quel est le volume de 1
partie et de 9 parties?
Déterminer la dilution requise
Dilution:
dilution
Une fraction du facteur de
Facteur de dilution = Conc. que j’ai
Conc. que je veux
Ex. Vous avez une solution de 25 mg/mL et
désirez une solution de 5mg/mL
Facteur de dilution = 25mg/mL = 5X
5mg/mL
Dilution = 1/le facteur de dilution = 1/5 = 1 partie/5 parties Totales
Exemple
Comment
est-ce que vous prépareriez
25 mL d’une solution de 2mM à partir
d’un solution mère de 0.1M
Quantités
Les
quantité ne sont PAS des
concentrations!
Ex
1.
Deux
pommes par sac = une concentration
Deux pommes = une quantité
Ex
2.
10g
par 100 mL = une concentration
10g = une quantité
D’une concentration aux quantités
La
concentration indique la quantité
dans un volume donné
Ex.
1mM = 1millimole par chaque litre
Donc la quantité dans 1 L est 1 millimole
Quel volume de la solution auriez vous
besoin pour avoir 0.05 millimole?
Les rapports
Façon
d’exprimer les solutions en
indiquant le rapport entre les
différentes composantes:
Rapports
masses
Rapports molaires
Rapports volumes
Les rapports masses
Ex.
12g de NaCl est dissout dans 100ml
d’eau
Convertir
mêmes
12g
les unités pour qu’elles soit les
de NaCl dans 100g d’eau
Diviser
les quantités par la valeur de la
plus petite quantité
12g/12g
Le
: 100g/12g
rapport
NaCl
: eau = 1:8,3
Les rapports molaires
Ex.
12g de NaCl est dissout dans 100ml
d’eau
Convertir
les unités en moles
12g/(58g/mole)
d’eau
de NaCl dans 100g/(18g/mole)
– 0,2 mole de NaCl : 5,6 moles d’eau
Diviser
les quantités par la valeur de la
plus petite quantité
0,2mole/0,2mole
Le
: 5,6moles/0,2moles
rapport
NaCl
: eau = 1:28
Les rapports volumes
Ex.
12ml d’alcool sont ajoutés à 1L
d’eau
Convertir
mêmes
12ml
les unités pour qu’elles soit les
d’alcool dans 1000ml d’eau
Diviser
les quantités par la valeur de la
plus petite quantité
12ml/12ml
Le
: 1000ml/12ml
rapport
Alcool
: eau = 1:83,3
Électrophorèse sur gel d’agarose
Séparation
de molécules d’acides
nucléiques simples ou doubles brins
d’après leur taille et leur conformation
Sépare
les fragments entre 100pb et 10 Kbp
Pouvoir de résolution entre fragments
≥100pb
-
Plasmide non digéré sur gel
Les
plasmide non digérés
génèrent un patron de
bandes
La migration est une
fonction de la taille et de la
conformation
Super
enroulé
Relâché
Multimèrs?
relâché
-
multimèrs
Super
enroulé
+
Migration d’ADN linéaire (plasmide digéré)
La
vitesse de migration est une fonction
de la taille
Les plus petits fragments migrent plus
rapidement
La vitesse de la migration est
inversement proportionnelle au log10 de
la taille
Migration d’ADN linéaire (plasmide digéré)
-
1000 bp
850 bp
750 bp
600 bp
200 bp
100 bp
+
Déterminer les tailles
100,000
Taille (pb) Distance (mm)
11.0
9,400
13.0
6,500
15.0
4,400
18.0
2,300
23.0
2,000
24.0
Taille paire de base
23,000
10,000
B
1,000
100
0
5
10
15
Distance, mm
20
A
25
30
Visualisation: Bromure d’éthidium
Colorant utilisé pour rendre les acides
nucléiques visibles
Fluorescent sous les UV
Liaison proportionnelle à
La taille
La quantité
La conformation
Que peut-on déterminer d’une
électrophorèse sur gel d’agarose?
Est-ce
qu’il y a de l’ADN
Combiens de conformations
Combien de fragments
Taille
des fragments
Taille totale des molécules d’acides nucléiques
Nombre de coupures
Linéaire?
Circulaire?