Biologie Moléculaire Compétences Techniques

Compétences

 Micropipetage  Préparation de solutions  Travailler avec les concentrations  Dilutions  Quantités  Électrophorèse sur gel d’agarose

Micropipetage- Mesurer de petits volumes

 Permet la mesure de microlitres (µL)  1 000 X moins que 1 millilitre  2-20 µL Max. 0.02 mL 50-200 µL 100-1000 µL 0.2mL

1mL

Réglage du volume- P20

Dizaines (0, 1=10 or 2=20) Unités (0-9) Décimale (1-9 = 0.1-0.9)

Réglage du volume- P200

Centaines (0, 1=100 ou 2=200) Dizaines (0, 1-9=10-90) Unités (1-9)

Réglage du volume - P1000

Milliers (0, 1=1000) Centaines (0, 1-9=100-900) Dizaines (0, 1-9=10 - 90)

Utilisation du micropipetteur

Étape 1 Insérer embout Étape 3 Insérer embout dans la solution a être prise Étape 4 Aspirer l’échantillon en relâchant lentement le piston Étape 2 Peser piston jusqu’au Premier arrêt Étape 5 Retirer pipetteur

Livraison

Commencer à livrer 1 er arrêt =livrer 2 e arrêt = expulsion

Directives pour reproductibilité optimale

 Utiliser le pipetteur dont le volume se rapproche le plus de celui désiré  VITESSE et FORCE consistante pour peser et relâcher le PISTON  PROFONDEUR D’IMMERSION consistante  3-4mm sous la surface  EVITER les bulles d’airs  Ne jamais aller au-delà des limites du pipetteur

Préparation des Solutions

Définitions

 Solution  Mélange de 2 substances ou plus dans une phase unique  Solution composée de deux composantes  Soluté – Partie qui est dissoute ou diluée – Habituellement la plus petite quantité  Solvant (OU Diluent) – Partie de la solution dans laquelle le soluté est dissout – Habituellement le plus grand volume

Concentrations

 Concentration = Quantité de soluté Quantité de solution (Pas solvant)  Trois façons d’exprimer les concentrations:  Concentration Molaire (Molarité)   Pourcentages Masse par volume

Molarité

 N o de Moles de soluté/Litre de solution  Masse de soluté/PM de soluté = Moles de soluté  Moles de soluté/vol en L de

solution

= Molarité

Pourcentages

 Les concentrations en pourcentage peuvent être exprimé en tant que :  V/V – volume de soluté/100 mL de solution  M/M – Masse de soluté/ 100g de solution  M/V – Masse de soluté/100 mL de solution  Tous représentent des fractions de 100

Pourcentages

(suite)  %V/V  Ex. 4.1L soluté/55L solution =7.5%  Doit avoir les mêmes unités en haut et en bas!

 %M/V  Ex. 16g soluté/50mL solution =32%  Dois avoir des unités du même ordre de grandeur en haut et en bas!

 % M/M  Ex. 1.7g soluté/35g solution =4.9%  Dois avoir les mêmes unités en haut et en bas!

Les Dilutions

La Réduction d’une Concentration Une Fraction

Dilutions

 Dilution = produire des solutions plus faibles à partir de solutions plus fortes  Exemple : Faire du jus d’orange à partir de concentré. Mélanger une cannette de concentré de jus d’orange congelé avec trois (3) cannettes d’eau

Dilutions (suite)

 Les dilutions sont exprimées comme le volume de la solution étant diluée par le volume total final de la dilution  Dans l’exemple du jus d’orange, la dilution serait exprimée comme 1/4, pour une cannette de jus à un TOTAL de quatre cannettes de jus dilué. Quand on parle de la dilution, vous diriez pour l’exemple du jus : « un dans quatre ».

Dilutions (suite)

 Un autre exemple :  Si vous diluez 1 ml de sérum avec 9 ml de salin, la dilution serait écrite 1/10 ou dite « un dans dix », car vous exprimez le volume de la solution étant diluée (1 ml de sérum) par le volume final TOTAL de la dilution (10 ml totaux).

Dilutions (suite)

 Un autre exemple :  Une (1) partie d’acide concentré est diluée avec 100 parties d’eau. Le volume total de solution est 101 parties (1 partie d’acide + 100 parties d’eau). La dilution est écrite comme 1/101 ou dite “un dans cent un ”.

Dilutions (suite)

 Remarquez que les dilutions n’ont pas d’unités (cannettes, ml, ou parties) mais sont plutôt exprimées comme un nombre par rapport à un autre nombre  Exemple : 1/10 ou « un dans dix»

Dilutions (suite)

 Les dilutions sont toujours exprimées avec la substance originale étant diluée comme étant un (1). Si plus d’une partie de la substance originale est initialement utilisée, il est nécessaire de convertir la partie de la substance originale à un (1) quand la dilution est exprimée.

Dilutions (suite) Exemple: Deux (2) parties d’un colorant sont diluées avec huit (8) parties de diluant. Le volume total de solution est 10 parties (2 parties de colorant + 8 parties de diluent). La dilution est initialement exprimée comme 2/10, mais la substance originale doit être exprimée comme étant un (1). Pour convertir le volume original à un (1), utiliser une équation de rapport et de proportion. Rappelez-vous que les dilutions sont exprimées en terme de 1 à quelque chose : __2 parties de colorant = ___1.0___

Volume total de 10 parties x 2 x = 10 x = 5 La dilution est exprimée comme étant 1/5.

Dilutions (suite) La dilution n’est pas toujours comme des nombres entiers.

Exemple:

Deux parties (2) de sang sont diluées avec cinq (5) parties de saline. Le volume total de solution est sept (7) parties (2 parties de sang + 5 parties de saline). La dilution serait 2/7, ou plus précisément 1/3.5. Encore une fois, ceci est calculé en utilisant une équation de rapports et de proportions. Rappelez-vous que les dilutions sont exprimées en terme de 1 à quelque chose: __2 parties de sang_____ = ___1.0___

Volume total de 7 parties x 2 x = 7 x = 3.5

La dilution est exprimée comme 1/3.5

Qu’est que cela veut dire??

  Si une solution possède une dilution de 1/10 le nombre représente 1 partie de l’échantillon ajouté à 9 parties de diluant. Si cette solution était préparée à un volume final de 110 mL, quels volumes de soluté et de solvent doivent être utilisés?  Ceci représente 1 partie d’échantillon ajoutée à 9 parties de diluant.

 En autres mots, quel est le volume de 1 partie et de 9 parties?

Facteur de Dilution

 EXEMPLE: Quel est le facteur de dilution si vous ajoutez 0.1 mL d’un spécimen à 9.9 mL de diluant?

 Le volume final est égal au volume de l’échantillon PLUS le volume du diluent: 0.1 mL + 9.9 mL = 10 mL  Le facteur de dilution est égal au volume final diviser par le volume de l’échantillon : 10 mL/0.1 mL = Facteur de dilution de 100X

Exemple d’un Problème

 Quel est le facteur de dilution quand 0.2 mL est ajouté à 3.8 mL de diluant?

Dilutions en série

 Si une dilution de 1/8 d’une solution mère est faite suivie par une dilution de 1/6 quelle est la dilution finale?

 La dilution finale est: 1/8 x 1/6 = 1/48

Dilutions

 Moyen de réduire une concentration  Dilution: Une fraction du facteur de dilution Facteur de dilution = Conc. que j’ai Conc. que je veux Ex. Vous avez une solution de 25 mg/mL et désirez une solution de 5mg/mL Facteur de dilution = 25mg/mL 5mg/mL = 5X Dilution = 1/le facteur de dilution = 1/5 = 1 partie/5 parties

Totales

Exemple

 Comment est-ce que vous prépareriez 25 mL d’une solution de 2mM à partir d’un mère de 0.1M

Quantités

 Les quantité ne sont PAS égales aux concentrations!

 Ex 1.  Deux pommes par sac = une concentration  Deux pommes = une quantité  Ex 2.

 10g par 100 mL = une concentration  10g = une quantité

D’une concentration aux quantités

 La concentration indique la quantité dans un volume donné  Ex. 1mM = 1millimole par chaque litre  Donc la quantité dans 1 L est 1 millimole  Quel volume de la solution auriez vous besoin pour avoir 0.05 millimoles?

Électrophorèse sur Gel d’Agarose

 Séparation de molécules d’acides nucléiques simples ou doubles brins d’après leur taille et leur conformation  Sépare les fragments entre 100pb et 10 Kbp  Pouvoir de résolution entre fragments ≥100pb

Migration Sur Gel d’Agarose

Puit Haut (-)

Linéaire Relâché Super enroulé

Direction de migration Bas (+)

Que peut-on déterminer d’une électrophorèse sur gel d’agarose?

 Est-ce qu’il y a de l’ADN  Combiens de conformations  Combien de fragments  Taille des fragments  Taille totale des molécules d’acides nucléiques  Nombre de coupures  Linéaire?

 Circulaire?

Profil de Migration sur Agarose

Résolution Résolution 1.0% 1.5% Distance de Migration

Taille (pb) Distance (mm)

23,000 11.0

9,400 13.0

6,500 4,400 2,300 2,000 15.0

18.0

23.0

24.0

10,000 1,000

B

100 0 5 10 15

Distance, mm

20

A

25 30