Transcript Vyšetření parametrů buněčné imunity

Vyšetření parametrů buněčné imunity
Stanovení povrchových znaků lymfocytů a dalších buněk
- vyšetření subpopulací lymfocytů; vyšetření exprese molekul – např
aktivační znak HLA DR na monocytech při monitorování pacientů
v sepsi)
Funkční testy lymfocytů
B lymfocyty- sledování produkce specifických protilátek (např. proti
tetanu)
- měření koncentrace Ig v supernatantu stimulovaných
B lymfocytů
T lymfocyty – test blastické transformace (aktivace lymfocytů),
schopnost T lymfocytů reagovat na polyklonální
mitogeny (PHA) nebo na specifický Ag (tetanický
toxoid…)
Cytotoxicita NK buněk a T lymfocytů
- stanovení funkce systému granzym/perforin, jde o složitou metodu,
která je prováděna na specializovaných pracovištích, musí být připraveny
efektorové buňky (TC, NK) a cílové buňky ( virem infikované buňky,
nádorové buňky nebo APC prezentující testovaný Ag). Ke stanovení se
používá radioaktivně značený chrom.
Fagocytóza
– k testu se používají mikrosférické hydrofilní partikule, nebo jiné
substráty (Sacharomyces cerevisiae, stafylokoky…). Poruchy fagocytosy
mohou odrážet i poruchu opsonizace, přenosu signálu, aktivace
nitrobuněčných struktur a funkce kontraktilních mechanismů.
Chemotaxe
- schopnost fagocytujících buněk doputovat do místa zánětu
- test in vivo : Rebuckovo kožní okénko
- test in vitro: test v agaróze s chemoatraktantem a další
Test oxidačního metabolismu
- sleduje se schopnost fagocytů redukovat bezbarvé substráty na
barevné; diagnostika poruch v NADPH-oxidázovém systému
Stanovení cytokinů
- nejčastěji se stanovují IL-6 (při podezření na sepsi, trauma, srdeční
selhání), IL-8 (jako IL-6, časná diagnostika ARDS- acute respiratory
distress syndrom), TNF (typický pro syndrom systémové zánětlivé
odpovědi)
- určení hladiny cytokinové mRNA pomocí RT-PCR
- stanovení cytokinů metodou ELISA
Test aktivace bazofilů
- po aktivaci bazofilů alergenem se stanovuje:
a) exprese aktivační molekuly CD 63 pomocí průtokové cytometrie
(BAT)
b) mediátory (histamin, sulfidopeptidové leukotrieny) uvolněné při
degranulaci (CAST)
Vyšetření apoptózy
- pomocí průtokové cytometrie či fluorescenčního mikroskopu (DNA se
značí pomocí propidium jodidu)
Typizace HLA = určení HLA antigenů na povrchu lymfocytů
1) Sérologická typizace
- mikrolymfocytotoxický test
- princip - inkubace lymfocytů s typizačními séry za přítomnosti
králičího komplementu, poté je přidáno vitální barvivo,
které obarví mrtvé buňky
- buňky nesoucí určité HLA jsou usmrceny cytotoxickými Ab
proti tomuto Ag, procento mrtvých buněk je mírou toxicity
séra (síly a titru antileukocytárních protilátek)
- za pozitivní reakci se považuje více než 10% mrtvých bb.
(sérologickou typizaci lze provádět i pomocí průtokové cytometrie)
2) molekulárně genetické metody
- pro typizaci se používají hypervariabilní úseky ve II. exonu genů
kódujících HLA II. třídy, pro určení HLA I. třídy se používá
polymorfismus v II. a III. exonu kódujících genů
2a) PCR-SSP
= polymerázová řetězová reakce se sekvenčními specifickými primery
- pozitivní a negativní reakce se hodnotí elektroforézou
2b) PCR-SSO
= PCR reakce se sekvenčně specifickými oligonukleotidy
- hybridizace s enzymaticky nebo radioaktivně značenými DNA
sondami specifickými pro jednotlivé alely
2c) PCR- SBT
= sequencing based typing; sekvenování
- nejpřesnější metodika HLA typizace
- získáme přesnou sekvenci nukleotidů, kterou porovnáme s databází
známých sekvencí HLA alel