Transcript kültür alma koloni sayma

KÜLTÜR ALMA ve KOLONİ
SAYMA YÖNTEMLERİ
KÜLTÜR ALMA TEKNİKLERİ
Mikrobiyolojide uygun örnek
toplama neden önemlidir?
Örnek toplama mikrobiyolojik
çalışmaların bel kemiğini oluşturur.
Farklı örnekler için faklı örnek toplama
yöntemleri vardır.
Kaliteli hizmet için bunlar mutlaka
uygulanmalıdır.
Örnek toplamadan önce
sorulması gereken önemli
sorular?
•
•
•
•
Enfeksiyon şüphesi var mı?
Enfeksiyonun doğal yapısı nedir?
(Bakteriyel, viral, mikolojik veya
parazitolojik)
Hangi test önceliklidir?
Uygun istem yapıldı mı?
Örnek toplamadan önce sorulması
gereken önemli sorular?
• Örnek;
Ne zaman,
Nereden,
Nasıl alınmalı?
• Doğru örnek kabı seçtim mi?
• Örneği neden hemen göndermeliyim,
gönderemezsem ne yapmalıyım ?
• Laboratuvara ne zaman göndermeliyim?
İDEAL İSTEM FORMU
•
•
•
•
•
•
Hasta adı :
yaşı:
cinsiyeti:
Tanı :
Zaman :
Tarih:
Alan kişi :
Acil / Rutin :
Örneğin yapısı:
Nereden alındığı:
Ne araştırılacağı:
Kullanılan antibiyotik:
Doktor/Hemşire
Telefon no:
bilgileri içermelidir.
Neden uygun yazılmış bir istem?
• İsteminiz yasal bir evraktır.
• Test sürecini belirler.
• Eksik istem formları olumsuzluklara yol
açabilir.
• Doktor tarafından doldurulmuş okunaklı
formların, laboratuvar-klinik ilişkisinde
önemli katkısı bulunur.
• Telefon numarası belirtilmesi hastayla ilgili
ciddi durumlarda kolay iletişimi sağlar.
Örnek en erken ne zaman
alınmalı?
ANTİBİYOTİK TEDAVİSİ
BAŞLANMADAN ÖNCE!!!
Nasıl kaplar kullanılmalı?
Kaplar;
• sızdırmaz,
• kırılmaz,
• steril
olmalıdır.
Yüksek riskli örnekler
işaretlenmelidir.
•
•
•
•
•
Tbc
Tifo,
Kolera,
Şarbon,
HIV/ HBV/HCV
şüpheli TÜM
ÖRNEKLER
Uygun sonuç için:
• Sonuç kalitesi hasta başında yapılan işlemlerle
yakın ilişkilidir.
• Uygun örnek alma ve transport işlemleri çok
önemlidir.
• Örnek toplama esnasında mikrobiyoloji ile
zamanında iletişim önemlidir.
• Toplama ve transport esnasındaki
olumsuzluklar laboratuvara mutlaka
bildirilmelidir.
• Örneği alan kişi kuralları bilmeli ve bu
kurallara mutlaka uymalıdır.
Örnek, (mümkünse)
kontaminasyonu minimum
düzeye indirecek
enfeksiyona kapalı
yerlerden alınmalıdır.
KAN KÜLTÜRÜ
 Kan miktarı sensitiviteyi etkileyen çok
önemli faktördür.
 Tek set; bir aerob bir anaerob
şişeden oluşur. İdeal olarak 10 ml kan
iki şişeye paylaştırılmalıdır.
• Tek set kan kültürünün duyarlılığı %5’
den azdır.
KAN KÜLTÜRÜ
• Alınan set sayısı ile gerçek sepsis pozitifliğini
yakalama arasında doğru ilişki vardır.
• Kateter kan kültürü örneği
– Kateterden kan kültürü alınırsa aynı
zamanda periferik damardan da alınmalıdır.
– Kan kültürü PPV’si;
• Aynı anda kateter ve venden alındığında
% 96
• Her ikisi de kataterden alındığında, %50
• Her ikisi de venden alındığında ise
%98’dir.
KAN KÜLTÜR ÖRNEKLERİ
*Ateş yükselmeden 1 saat önce veya ateş
yükselir yükselmez
*Kanda en yüksek konsantrasyon
*Ateşin ne zaman yükseleceğinin tespiti
zor olduğu için 3 set kan kültürü/24 saat
*Antibiyotik verilmeden hemen önce
ŞİŞE HAZIRLAMA
Hasta barkodu şişe barkodunu
kapatmayacak şekilde
yapıştırılır.
KAN KÜLTÜR ÖRNEKLERİ-2
• Deri% 70 isopropil veya etil alkolle temizlendikten
sonra 1-1,5 dakika beklenir, %2 iodin ile silinir
1 dakika beklenir tekrar palpe edilmeden kan alınır.
*Yetişkinler için her şişeye en az 5 ml kan alınır.
Kültür şişesi kapağı %70 alkolle dezenfekte edilip kan
aseptik koşullarda şişeye boşaltılır.
KAN KÜLTÜR ÖRNEKLERİ-2
Şişe üzerine kanın alındığı saat ve yer (Periferik
damar, kateter) yazılır.
Kan örneğinin uygun şişeye konulup konulmadığı
kontrol
edildikten
sonra
laboratuvara
gönderilmelidir.
Gönderilemiyorsa oda ısısında bekletilmeli, kesinlikle
buz dolabına konulmamalıdır!!!!!
KAN KÜLTÜR ÖRNEKLERİ-3
*2 saat oda ısısında bekletilebilir. Zorunlu
hallerde 24 saate kadar oda ısısında
bekleyebilir. Kan kültür şişesi kesinlikle
buzdolabına konmaz.
* Kan kültürü alma tarihi ve saati hastaya
ait bilgilerle beraber ve şüphelenilen
infeksiyon mutlaka belirtilir.
VÜCUT SIVI ÖRNEKLERİ
BOS
. Yeterli miktarda örnek gönderilmelidir.
*BOS örnekleri laboratuvara 15 dakika
içinde
ulaşmalıdır.
Kesinlikle
buzdolabında bekletilmemelidir.
Asit , Safra , Perikard ,
Plevra ve Sinoviyal Sıvılar
Yeterli
miktarda
örnek
bekletilmeden
laboratuvara
gönderilmelidir.
Buzdolabında
bekletilmemelidir.
*
GERÇEK ETKEN İZOLASYONU
İÇİN;
• Örneği uygun zamanda alınız.
• Patojen izolasyonunu
kolaylaştıracak zaman aralığını
kullanınız.
• Yeterli miktarda örnek alınız.
PERSONEL EĞİTİMİ
Doktor ve hemşireler örnek toplama
konusunda yeterli donanıma sahip
olmalıdırlar.
Personelin bilgileri periyodik
eğitimlerle güncellenmelidir.
YARA ÖRNEKLERİ
• Laboratuvar araştırmaları için
genellikle püy ve eksuda swapla
laboratuvara gönderilir.
• Swap etkili bir örnek toplama aracı
değildir.
YARA ÖRNEKLERİ
*İstemde:
Örneklerin alındığı spesifik anatomik bölge
mutlaka belirtilmelidir.
*Yüzeyel yara ile derin veya cerrahi yaralar
ayırt edilmelidir.
*Cilt flora bakterileri ile kontaminasyon
değerlendirmeyi güçleştirdiği için aspirat
veya
biyopsi
edilmelidir.
örnekleri
*İnfeksiyonu temsil eden örnek
ilerleyen kenarından alınmalıdır.
tercih
lezyonun
YARA ÖRNEKLERİ
*Yanık yaralarından kültür:
Temizleme ve
debridman sonrası alınmalı ve biyopsi
örnekleri tercih edilmelidir.
*Tüm örnekler en geç 1 saat içinde lab.’a
gönderilmelidir.
*Zorunlu
hallerde
24
ısısında bekletilebilir.
saate
kadar
oda
Yüzeyel Yaralar
*Aspirasyon örnekleri tercih edilmelidir.
*Cilt %70 alkol ve iyot solüsyonu ile dezenfekte
edilmelidir .
*2-5 ml enjektör ile lezyon tabanından
aspirasyon yapılmalıdır.
*Eğer materyal gelmez ise steril SF verilerek
aspirasyon tekrarlanmalıdır.
* Eğer vezikül veya bül varsa hem sıvı hem
lezyon tabanındaki hücreler aspire edilmelidir.
Derin Yaralar ve Apseler
*Yüzey dezenfeksiyonu yapılmalıdır.
*Lezyon tabanından aspirasyon
yapılmalı ve steril SF içerisinde
gönderilmelidir.
Kültür İçin Örnek
Alınırken Dikkat Edilmesi
Gereken Koşullar:
1-Örnek esas enfeksiyon bölgesinden alınmalıdır.
Bu sırada bitişik doku, organ veya sekresyonlara
temas edilmemelidir.
2-Etken mikroorganizmanın izolasyon şansı,
muayene maddesinin uygun zamanda alınmasına
bağlıdır.
Sabah alınan örnekler konsantredir ve
patojenleri
en
yüksek
konsantrasyonda
içerirler. Sabah alınan ilk idrar ve balgam
örneklerinde
aside
dirençli
bakteriler,
mantarlar ve diğer patojenler için optimum
üreme sağlanır.
3-İstenen
kültür
tekniklerini
uygulayabilmek için yeterli miktarda
örnek
alınmalıdır.
Yetersiz
miktarlar yanlış negatif sonuca yol
açabilir.
4-Uygun örnek alma araçları ve
steril örnek kapları kullanarak,
aseptik teknikle örnek alınmalı.
5-Örnek mümkünse antibiyotik
verilmeden önce alınmalıdır.
6-Uygun istem yapılmalıdır.
7-Örneğin
alındığı yerin bulunduğu
anatomik bölge tanımlanmalıdır.
8-Örnekler mümkün olan en kısa
sürede
(30
dakika
içinde)
laboratuvara gönderilmelidir.
.
ÖRNEKLERİ
SAKLAMA KOŞULLARI
• Buzdolabı ısısında (+4° C)
-İdrar
-Dışkı, rektal sürüntü
-Virüs, klamidya, mikoplazma tanımlanacak
örnekler (En fazla 24 saat!)
-Balgam, BAL
-Mantar kültürü için alınmış örnekler
• Oda ısısında (22° C )
-Anaerop örnekler
-Kan (otomatik sistemler için)
-Genital bölgeden örnekler,
-Göz, iç kulak örnekleri
-Vücut sıvıları(peritoneal, perikardiyal,
plevral, safra, eklem sıvısı)
-Boğaz, nazofarenks sürüntüsü
• Vücut ısısında (37° C)
-BOS (hemen ekilmeli)
-Gastrik biyopsi (hemen ekilmeli)
-Kemik, kemik iliği
• Dondurucu ısısında (-20 /-70° C)
-Serum örnekleri
-Dokular (-70° C) (formol veya alkol
koyulmamalı)
- Bakteri stok kültürleri
- Virüs tanımlanacak örnekler
- Uzun süre saklanacak tüm örnekler (-70° C)
İDRAR ÖRNEKLERİ
*Böbrekler, üreter ve mesane normalde
sterildir.
*Atılırken
üretradaki
kontaminasyon oluşur
bakterilerle
İDRAR ÖRNEKLERİ-2
*Dışardan bulaş
önlenmeli
*Steril, geniş
ağızlı kaplar
*Sabah idrarı/
mesanede 4 saat
beklemiş idrar
İDRAR ÖRNEKLERİ-3
*Orta akım idrarı
*Sonda ile idrar alınması
*Suprapubik aspirasyon
İDRAR ÖRNEKLERİ-4
Orta akım idrar örneği
*İlk 10-15 ml idrar dışarı atılır.
*Orta akım idrar örneği steril idrar kabına
alınır.
*Son idrar dışarı atılır.
*Örnek en az 10 ml
İDRAR ÖRNEKLERİ-5
Taşıma ve saklama koşulları:
*oda ısısında hemen laboratuvara ulaştırılmalı.
*Zorunlu durumlarda +4 oC'de en fazla 24 saat
saklanabilir.
.
İDRAR ÖRNEKLERİ-6
Üriner sistem
tüberkülozu şüphesinde
*3 gün, sabah idrarı steril kaplara alınarak
hemen laboratuvara gönderilmelidir.
*24 saatlik idrar toplanması uygun değildir.
İDRAR ÖRNEKLERİ-7
Kateter ile idrar örneği alımı:
*Aseptik kurallara uygun olarak kateter
mesaneye yerleştirilir.
* İdrarın ilk 15 ml'si akıtıldıktan sonra
gelen kısmı steril kap içerisine alınır.
*Yüksek oranda hastane infeksiyon riski
taşıdığı için kaçınılmalıdır.
İDRAR ÖRNEKLERİ-8
Sürekli idrar kateteri ile idrar örneği alımı:
*İdrar torbasının borusu klemplenerek idrar
birikmesi sağlanır.
*Kateterden örnek alınacak bölge % 70’lik
alkol ile silinerek dezenfekte edilir.
*Enjektör ile 5-10 ml idrar alınır ve steril bir
tüp ya da kap içerisine aktarılarak göderilir.
İDRAR ÖRNEKLERİ-9
Bebeklerde plastik torbalarla idrar örneği
*Bebekte
penis/vulva
çevresi
iyice
temizlenir. Steril idrar toplama torbaları
yapıştırılarak
sık
sık
izlenir.
(45 dk içinde idrar toplanamazsa yeni
torba)
bekletilmeden
laboratuvara
gönderilir.
NOT: Yenidoğan ve küçük bebekler
dışında
idrar
torbalarından
mikrobiyolojik örnek alınmaz.
İDRAR ÖRNEKLERİ-10
Suprapubik aspirasyon:
*Yenidoğanlar, küçük bebekler ve
temizleme yöntemi ile idrar alınmasına
rağmen başarısız olan erişkinlerde
GAİTA ÖRNEKLERİ
*Örnek kaplarının steril olması gerekmez.
*Temiz geniş ağızlı ve kapalı kaplar
yeterlidir.
*Parazit incelemesinde örnekler
bekletilmeden lab’.a ulaştırılmalıdır.
Spesifik mikrorganizmalar aranacaksa
önceden laboratuvar bilgilendirilir
GAİTA ÖRNEKLERİ-2
*Baryum , magnezyum veya kristal bileşikleri
uygulamasından hemen sonra alınan örnekler
parazit incelemesi için uygun değildir. İlk
uygulamadan 5 gün sonra örnek alınmalıdır.
*Gaita kültürlerinde anaerobik inceleme
yapılmaz.
*Kültür için örnekler 1 saat içinde laboratuarda
olmalı bu sağlanamıyorsa 24 saati aşmayacak
şekilde buzdolabında saklanabilir.
KOLONİ SAYMA YÖNTEMLERİ
• Koloni Sayımı
Bu yöntemlerin prensibi mikroorganizmanın
katı besiyerinde koloni oluturması, bu
kolonilerin sayılarak örnekteki
mikroorganizma sayısının hesaplanmasıdır.
Dökme, yayma ve
damlatma olarak 3 ekilde uygulanır
Dökme Yöntemi
Dökme yönteminde 1 ml örnek steril petri
kutusuna pipetlenir, üzerine 45 oC 'a kadar
soğutulmuş agarlı besiyerinden yaklaşık 15 ml
dökülür, besiyeri ile örnek karıştırılır, besiyeri
katılaştıktan sonra petri kutuları inkübasyona
bırakılır. Bu yöntemin avantajı ekim yapılacak
tüpten 1 ml pipetlendiği için yayma yöntemine
göre 10 misli daha az mikroorganizma içeren
örneklerde sayım yapılabilmesidir
Yayma Yöntemi
Yayma yönteminin esası, önceden petri
kutularına dökülüp katılaştırılmış (hatta bu
şekilde
stoklanmış) ve belirli bir düzeyde kurutulmuş
besiyerleri üzerine 0,1 ml örnek aktarılarak
drigalski spatülü denilen kıvrık bir cam baget ile
bu miktarın besiyeri yüzeyine yayılmasıdır.
Damlatma Yöntemi
Damlatma yönteminde ise 0,01 (ya da 0,05 ;
besiyeri uygun ise 0,1) ml örnek petri
kutusunda
önceden dökülmüş, katılaştırılmış ve belirli bir
düzeyde kurutulmuş besiyeri üzerine
damlatılır, yayma yapılmadan besiyerinin
damlayı emmesi beklenir. Dolayısı ile koloniler
sadece yaklaşık 2-3 cm kadar çapı olan bir
alanda yoğun ve bu nedenle küçük olarak
gelişir.
Bu yöntemin rutin gıda kontrolünde kullanımı
yaygın deildir. Bir petri kutusunun tabanının
2; 3; 4; hatta 6' ya bölünerek her bölmede farklı
örnek ve/veya seyreltiden ekim yapılması,
buna göre laboratuvarda besiyeri ve petri
kutusundan tasarruf salanması bu yöntemin
en
büyük avantajıdır. Bu yöntem sayımdan ziyade
titre belirleme (yarı kantitatif sayım) amacıyla
kullanılabilir.
Petri film
Besiyeri bir film tabakası halinde plastik bir
destek tabakasına bir film tabakası halinde
dökülmüş, kurutulmuş ve bu şekilde kullanıma
hazır steril preparat haline getirilmiştir. Analiz
aşamasında üstteki korutucu tabaka kaldırılarak
1 ml örnek 5 cm çaplı bu alana aktarılır,
koruyucu tabaka kapatılır ve özel bir aparatla bu
hacmin tüm alana eşit olarak dağılması
sağlanır. Standart inkübasyon sonunda koloniler
sayılarak işlem bitirilir.
Koloni Sayısının Hesaplanması
Hangi yöntem kullanılırsa kullanılsın inkübasyon
bitiminde petri kutularında sayım vakit
geçirmeden yapılmalıdır. Önceleri 30-300
arasındaki koloni içeren seyreltilerdeki ekimler
dikkate alınır iken, son zamanlarda ardışık iki
seyreltiden yapılan ekim sonuçlarından
hareketle ve ağırlıklı aritmetik ortalama ile
örnekteki sayı hesaplanmaktadır.
En Muhtemel Sayı (EMS) Yöntemi
Yöntemin prensibi ardışık 3 seyreltiden sıvı
besiyerlerine ekim yapıp inkübasyon sonunda
gelime olanları pozitif olarak değerlendirmek ve
istatistik yöntemlerle elde edilmiş
tablolardan yararlanılarak örnekteki sayıyı
hesaplamaktır
Spiral Plak Yöntemi
Spiral plak yöntemi uygun katı besiyeri içeren
petri kutularına spiral eklinde (Arşimet
spirali) bir eksen etrafında dönen sistemde sıvı
inokülümün dağıtıcı bir kol ile merkezden
kenarlara doru seyrelerek ekim yapılmasıdır.
Cihaza tutturulmuş olan özel şırınga örnek
hacmini 10000:1 'e kadar azaltarak dağıtmakta
olup besiyerinin her bölmesine bırakılan sıvı
miktarı bellidir.
Uygun sıcaklıkta inkübasyon sonucunda koloni
gelişiminin merkezde daha
yüksek yoğunlukta olmak üzere kenarlara doru
azalarak meydana geldiği gözlenir.
Yöntemde sayım, manuel olarak sisteme ait bir
grid (şablon) kullanılarak veya lazerle çalışan
elektronik sayıcılarla yapılır. Kolonilerin gerçek
yoğunluğuna balı olarak bir veya daha fazla
alanda görünen koloniler sayılır
Spiral plak sisteminde sadece örnek sisteme
verilmekte,
cihaz örneği otomatik olarak analize almakta ve
sonraki örnek için sistemi sterilize
etmektedir. Her ne kadar spiral plak analizinde
kullanılan cihaz yüksek maliyet ile elde
edilmekte ise de, analiz işlemleri sırasında bata
besiyeri ve seyreltme tüplerinden tasarruf
edilmekte, ayrıca pipet gibi laboratuvar
malzemesi kullanılmamakta, böylece analiz
giderleri
kayda değer ölçüde azalmaktadır
Yüzeyden Yapılan Sayımlar
Çalıma tezgahları ve gövde et gibi çok farklı materyalde
yüzeyden alınacak örneklerde çeşitli
mikroorganizmaların sayımı yapılmaktadır. Daha
önceleri standart bir alan steril bir şekilde
işaretlenerek buradan sürtme (swab) yöntemi ile örnek
alınmakta, bu sürtme çubukları örnek
olarak kabul edilmekte, buradan standart seyreltme ile
ekim yapılmakta iken bugün "dip
slide" adı verilen ve pek çok ticari firma tarafından
pazarlanan hazır besiyerleri bu amaçla
kullanılmaktadır.
Bu hazır besiyerleri, alanı belirli bir plastik levha
üzerinde genellikle ön ve
arkada farklı agarlı besiyerlerini hafif dışa doğru
bombeli bir şekilde bulunduran, böylelikle
aynı örnekte aynı sıcaklıkta inkübe edilecek 2
farklı mikroorganizmayı beraberce kontrol
edebilecek sistemlerdir.
Havadan Örnek Alma
Çeşitli gıda iletmelerinde havada bulunan
mikroorganizma sayısının bilinmesi ve buna balı
olarak önlem alınması gerekmektedir. Havada bulunan
mikroorganizma sayısını belirlemede
en pratik gibi görülen yöntem, çalıma ortamına amaca
uygun besiyeri dökülmüş bir petri
kutusunun kapağının belirli bir süre açık bırakılması ise
de, bu uygulamada belirli bir süre içinde iletme
havasındaki sirkülasyona balı olarak farklı sayım
sonuçları elde edilebilmesi
gibi kayda değer bir dezavantajı vardır
Membran Filitrasyon Teknii
Membran filitrasyon yöntemi su (içme, iletme,
kullanma), merubat gibi sıvı gıdaların ve
eker, tuz gibi suda tam olarak çözülen katı
gıdaların analizinde ve özellikle gıdada
aranılan
mikroorganizma sayısı 10 ml 'de 1 ve daha az
gibi standart EMS yöntemi ile
belirlenemeyecek kadar az ise uygulanabilecek
hemen hemen tek yöntemdir.
Her ne kadar
EMS yöntemi ile teorik olarak 3 adet 10'ar litre
besiyerine 1'er litre, 3 adet 1'er litre besiyerine
100' er ml ve 3 adet 100' er ml besiyerine 10' ar
ml ekim gibi uygulamalar ile EMS
yönteminin duyarlıı artırılabilirse de bu tip
uygulamaların rutin gıda kontrollerinde yeri
yoktur.
Metabolizmaya Dayalı Sayımlar
Mikrobiyel aktivitenin ölçülmesine dayanan pek
çok sistem içinde gıdaların rutin kontrolünde
yaygın olarak kullanılan yöntem elektriki
impedans ölçümüdür.
Mikroskobik Sayımlar
Bu sayım yöntemleri mikroorganizma sayımı yapılacak
olan materyalin mikroskop altında
incelenmesi prensibine dayanmaktadır. Bu amaçla çok
sayıda sayım teknii ve bu tekniklere
uygun ekipmanlar gelitirilmitir. Direk mikroskobik sayım
yöntemleri canlı ve ölü tüm
mikroorganizmaların sayılması gibi önemli bir
dezavantaja sahip olmakla birlikte bu
yöntemlerin bata sayım süresi ve maliyet olmak üzere
pek çok üstün yanı da bulunmaktadır.
Thoma Lamı ile Sayım