Transcript 细胞内记录
听中枢单个神经元对听觉刺激 的反应（在体细胞内记录） 【实验目的】 学习在体细胞内记录听中枢单个神经元对 听觉刺激反应的方法；掌握动作电位的各 个时相特征。 【实验原理】 1.电信号： • 局部电位（localized graded potential）：感受器、突触后膜、运动终板。 • 动作电位（action potential）：在神经纤维上传到的AP称为神经冲动。 2. 化学性信息（化学性突触传递） ：神经递质，激素。 神经元轴突内神经活动的电变化 在神经机制探索中，唯一最重要的发现是神 经冲动与电位变化相一致。神经活动的电信号给 予研究者一个研究神经系统功能的手段；电信号 像一个示踪物，通过它，研究者可在活体的复杂 结构中跟踪神经冲动的去向，同时，也是了解信 息如何在神经系统内编码的唯一线索。 Methods of Reconding Action Potentials 电生理学研究的指标 • 神经纤维上传导的动作电位（all or non ，不衰减性传导）： 分析其频率、潜伏期、传导速度； • 神经元胞体及树突产生的局部电位（幅度总和）：感受器， 突触后膜EPSP、IPSP，运动终板； • 神经递质和受体。 • 电压和化学门控通道：理、化性质。 细胞内纪录 Intracellular Single Unit Recording •工作原理：在膜两侧各置一个电极形成 一个回路，记录膜电位（membrane potential）： EPSP, IPSP，动作电位。 •优点: 准确测量膜电位的绝对值， 因膜 内到膜外电阻很大, 值可高达100mV。 •意义：是研究神经元基本生物物理特性 的有效手段。 •关键问题（成功而持久的胞内记录）： 1）稳定：排除机械和动物呼吸和循环功 能引起的运动； 2）合格的玻璃微电极。 (Hodgkin and Huxley) 细胞内纪录 Intracellular Single Unit Recording 由于插入神经元内胞体并记录细 胞内电位的微电极技术的发展， Eccles等首先将微电极插入脊髓运动 神经元的胞体，记录哺乳类动物脊髓 的大运动神经元胞内电位。 •运动神经元的胞体直径70m; •微电极尖端直径0.5 m； •跨膜电位差60~80mV。 细胞内记录仪器连接示意图 电动推进器 控制装置 电动推进器 微电极 实验 动物 扬声器 无回声屏蔽室 示波器 细胞内放大器 TDT系统 模数转换 计算机1 计算机2 【实验对象】 昆明小鼠 【实验器具】 听觉电生理工作站（TDT系统），细胞内 放大器，数据存储及分析系统，电极拉制 仪，声级计，三维操纵器，玻璃微电极， 醋酸甲、常用手术器械等。 【实验步骤】 1. 动物手术与电极制备 动物手术时，用质量分数为0.48%戊巴比妥钠 （Netbutal，0.02 mL/g b.wt.）腹腔注射麻醉后，用手术刀 沿头顶正中切开头皮，暴露头顶颅骨，除去颅骨表面组织 后，用95%酒精使其脱脂。将1根长约2.0 cm的平头钉用 LOTITE 406强力胶水粘定于头顶颅骨，并用牙科水泥加固， 供记录时固定动物头部。用利针在下丘（inferior colliculus， IC）所在部位颅骨上方钻一个直径为200～500 μm的小孔， 暴露下丘，以供插入微电极。实验开始前，将单管厚壁 （外径1.5 mm，内径0.86 mm）有芯玻璃微管（1B150F-4， WPI，USA）在微电极拉制器（PULL-100，WPI，USA） 上拉制成尖端直径小于1 μm的微电极，电极内充灌3 mol/L的醋酸甲溶液，阻抗 > 20 MΩ。 2. 声刺激和神经元反应的记录 自由声场刺激，纯音刺激信号由TDT系统 (Tucker-Davis Technology system 3, Alachua, USA) 给出，扬声器中心与小鼠鼻 眼线处于同一水平，位于小鼠对侧60°，正对外耳道口。通过 计算机控制TDT系统的给声频率和强度，纯音频率为神经元的 最佳频率或特征频率。声刺激系统用声级计 (B & K-2610， Denmark) 和1/4英寸麦克风 (4936，B & K) 校正，声压输出用 dB SPL 表示，0 dB相当于20 μPa 均方根。实验时，将制备好的 动物移入无回声的声-电屏蔽室内，将动物固定于防震台上， 用电动微电极推进器（MO- 81, Narishige, Japan）将单管玻璃微 电极插入IC神经元内，对记录到的IC神经元首先记录神经元的 深度和BF，将神经元对声刺激的反应输至细胞内放大器 （DUO-773 Dual Micrprobe System 3, WPI, USA），经滤波和放 大后并联输出至示波器显示和生物电信号采集分析系统 （Axon Digidata 1322A）数字化处理后存储于计算机内，供实 验结束后做进一步处理。 3. 数据采集与分析 实验中寻找神经元时，将时程固定为40 ms、 强度固定为80 dB SPL，改变声频率来寻找声敏感 神经元。找到神经元后，首先记录其记录深度 （recording depth）,最佳频率（best frequency，BF） 和静息电位（resting potential，RP）。之后采用生 物信号采集系统（pCLAMP8.0，Axon，USA）记 录声刺激下神经元的反应，以便数据做处理和分 析。