Transcript מצגת של PowerPoint

‫נושא‪ :‬אנזים הרסטריקציה הדרוש לחיתוך הפלסמיד המשובט‪.‬‬
‫שיבוט הוא החדרת מקטע ‪ D.N.A‬של ייצור אחד לתוך ‪ D.N.A‬של‬
‫ייצור אחר‪ ,‬והוא מתאפשר הודות לכך שה ‪ D.N.A‬הוא משותף לכל‬
‫עולם החי והצומח‪.‬‬
‫כדי שנוכל להחדיר גן מייצור אחד לייצור אחר אנו צריכים להוציא את‬
‫הגן שרוצים להחדיר מ ‪ D.N.A‬של הייצור בעזרת אנזימי רסטריקציה‬
‫שהם מעיין "מספריים מולקולריות"‪ .‬ולחתוך את הנשא באותו אנזים‬
‫הגבלה‪ .‬לאחר החיתוך יש לאפשר לגן ולנשא להתחבר בתהליך שנקרא‬
‫ליגציה‪ ,‬לאחר מכן יש להחדיר את הנשא המשובט לחיידק בתהליך‬
‫הטרנספורמציה‪ ,‬לזרוע את החיידקים על מצעי ברירה ולבודד את‬
‫המושבות "החשודות" כמשובטות‪.‬‬
‫כדי לבדוק האם אכן החיידקים קלטו פלסמיד משובט יש להפיק את‬
‫הפלסמידים מהמושבות החשודות כמשובטות‪ ,‬לחתוך את הפלסמיד‬
‫שוב בעזרת אותו אנזים רסטריקציה שבעזרתו שיבטנו את הגן‪,‬‬
‫ולהריץ אותו בג'ל אלקטרופורזה‪.‬‬
‫מהלך העבודה ‪:‬‬
‫בדיקת השפעת סוג אנזים ההגבלה על החיתוך‪:‬‬
‫ערכנו ‪ 3‬טיפולים בכל אחד אנזים ההגבלה היה שונה‪,‬‬
‫הטיפולים‪:‬‬
‫‪.1‬חיתוך ע"י האנזים ‪.PVU II‬‬
‫‪ .2‬חיתוך ע"י האנזים ‪.Eco RI‬‬
‫‪ .3‬חיתוך ע"י האנזים ‪.SaI I‬‬
‫בכל טיפול ערכנו ‪ 2‬חזרות‪.‬‬
‫שאלת המחקר‪ :‬בעזרת איזה אנזים רסטריקציה יש לחתוך‬
‫את הפלסמיד המשובט על מנת לוודא החדרת הגן?‬
‫השערה‪ :‬אנו משערים כי אנזים הרסטריקציה‪ ,‬שבעזרתו‬
‫שיבטנו את הגן יאפשר וידוא השיבוט‪.‬‬
‫המשתנים‪:‬‬
‫משתנה בלתי תלוי‪ :‬סוג אנזים החיתוך ‪ -‬גרמנו לו להשתנות‬
‫בכך שהשתמשנו באנזים שונה בכל טיפול‪.‬‬
‫משתנה תלוי ואופן מדידתו‪ :‬אורך המקטעים )‪)kb‬‬
‫המתקבלים בהרצה בג'ל אלקטרופורזה‪ .‬את אורך המקטעים‬
‫אנו קובעים על סמך השוואה להרצת סמן הגודל‪.‬‬
‫הציוד שהשתמשנו בו בניסוי‬
‫אינקובטור‪:‬‬
‫‪Orbital shaker incubator‬‬
‫)‪(mrc‬‬
‫מכשיר ‪E-Gel‬‬
‫תמונת הרצה בג'ל אלקטרופורזה של הפלסמידים החתוכים באנזימי הגבלה‬
‫תוצאות‬
‫ממוצע מספר הבנדים שהתקבלו ואורכם כתלות באנזימי החיתוך‬
‫סוג האנזים‬
‫מספר הבנדים‬
‫אורך הבנדים ( ‪)Kb‬‬
‫‪PVU II‬‬
‫הרבה‬
‫הגדול ביותר – מעל‬
‫‪6557‬‬
‫הקטן – בין ‪ 564‬ל‪600‬‬
‫‪Eco R1‬‬
‫‪2‬‬
‫הגדול – מעל ‪23130‬‬
‫הקטן – מעל ‪9416‬‬
‫‪SaI I‬‬
‫‪1‬‬
‫הבנד היחיד – בערך‬
‫‪4,000‬‬
‫דיון ומסקנות‪:‬‬
‫בניסוי שלנו השתמשנו באנזים ‪ HindIII‬על מנת לחתוך את ה‬
‫‪ insert‬ואת הפלסמיד‪.‬‬
‫לצערנו הייתה בעיה בניסוי שלנו בחיידקים הקומפוטנטים‪,‬‬
‫החיידקים לא קלטו פלסמידים לתוכם כנראה בגלל שהתנאים‬
‫בהם החיידקים נמצאו בעת העברתם לביה"ס לא היו מתאימים‬
‫– טמפרטורה לא קבועה של‪ . –700C‬לכן השתמשנו בחידקים‬
‫שעברו טרנספורמציה מוצלחת כדי להמשיך את הניסוי‪ .‬לצורך‬
‫שיבוט החיידקים הללו השתמשו באנזים ‪.PVU II‬‬
‫בעזרת האנזים‪ PVU II‬ניתן לחתוך את הפלסמיד המשובט‬
‫ולהוציא ממנו את הגן שהוחדר‪ .‬לפי הניסוי האנזים ‪ PVU II‬הוא‬
‫האנזים האידאלי שאיתו מומלץ לחתוך את הפלסמיד המשובט‬
‫לפני ההרצה בג'ל‪ .‬מכיוון שלפי התמונות של ההרצה אנו רואים‬
‫שבהרצה של החיתוך של הפלסמיד אנו רואים שישנם שתי‬
‫בנדים עיקריים‪ ,‬אחד גדול ואחד קטן‪ .‬לפי הבדיקה עם סמן‬
‫הגודל אנו רואים שהגדול הוא מתאים לגודל של הפלסמיד‬
‫שהוא ‪ , 3000kb‬והגודל של הקטן מתאים לגודל של הגן ( בין‬
‫‪ 564 kb‬ל ‪.)600 kb‬‬
‫האנזימים האחרים ‪ Eco R1‬ו ‪ SaI I‬אינם מתאימים לחיתוך לבדיקת‬
‫הפלסמיד המשובט‪.‬‬
‫אנו רואים לפי התמונה של תוצאות ההרצה שבפלסמיד שחתכנו‬
‫אותו בעזרת האנזים ‪ Eco R1‬התקבלו שני בנדים גדולים‪ ,‬שעל‬
‫פי גודלם ניתן לראות שאף אחד מהם אינו מתאים להיות הגן‬
‫שהוחדר ‪ .‬הבנד הגדול מבינהם הוא הפלסמיד המשובט‬
‫שבמהלך ההפקה נפתח גדיל אחד שלו ( ‪ )nic‬והשני הוא‬
‫הפלסמיד המשובט בצורת ‪ .super coil‬גם לפי התוצאות של‬
‫ההרצה של הפלסמיד שחתכנו בעזרת האנזים ‪ SaI I‬אינו‬
‫מתאים מכיוון שקיבלנו רק בנד אחד שהוא בעצם הפלסמיד‪.‬‬
‫הצעות לשיפור‪:‬‬
‫מספר חזרות גדול יותר – ‪ 10‬חזרות על מנת שהתוצאות יהיו מהימנות וניתן יהיה‬
‫להוציא תוצאות חריגות‪.‬‬
‫שימוש באנזימי הגבלה נוספים על מנת למצוא אם יש עוד אנזימים שמתאימים‬
‫להוצאת האינסרט מהפלסמיד‪.‬‬
‫בקרה חיצונית – הרצה בג'ל של הפלסמיד המשובט ללא חיתוכו באנזים הגבלה‪.‬‬