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微生物生物技术及应用 张 松 华南师范大学生命科学学院 教材及参考书： (1)黄秀梨、辛明秀.微生物学，高等教育出版社，2009 (2)张 松.微生物学多媒体教学软件（网络版）.北京：高等教育 出版社.2006. (3)黄文芳，张 松.微生物学实验指导.广州：暨南大学出版 社.2003. (4)黄秀梨、辛明秀.微生物学实验指导.高等教育出版社，2008 . (5)张 松.食用菌学.广州：广州：华南理工大学出版社,2000。 (6)周德庆，微生物学教程，高等教育出版社，2002 (7)沈萍，微生物学，高等教育出版社，2006 (8)Lansing M. Prescott, Microbiology 5th ed 影印版，高等 教育出版社，2000 (9)Madigan M T et al.Brock’Biology of Microorganism,10/e,Prentice Hall,2003 微生物与我们的生活 微生物类型 1、原核微生物：细菌、放线菌、衣原体 2、真核微生物：酵母菌、霉菌 3、非细胞型微生物：病毒、亚病毒因子 病毒 古代酿酒 酵母菌兼性厌氧微生物（有氧、无氧） 乙醇发酵： 酵母菌 C6H12O6--------- 2CH3CH2OH+2CO2+2ATP 果酒 果醋：醋酸菌：好氧（O2） 毛霉形态： 菌丝无隔膜 孢囊孢子 接合孢子 应用：酿造腐乳 1、前发酵：毛霉的生长，15-20℃，菌膜形成； 毛霉（蛋白酶等） 蛋白质------------------氨基酸 2、后发酵：风味形成。 乳酸发酵 泡菜、酸奶 微生物无处不在，我们无时不生活在“微生物的海洋”中。 土壤； 纸币（成都制造出抗菌人民币，2003）； 家居环境（菜板、抹布等）； 人体体表及体内（口腔、皮肤、肠道等） ： 空气（每个喷嚏的飞沫含4500-150000个细菌，重感冒患者为8500万）； 时时刻刻与微生物“共舞” 是 祸？是 福？ 微生物既是人类的敌人，更是人类的朋友！ 微生物是人类的朋友！ 物质循环； 体内的正常菌群是人及动物健康的基本保证； 有用物质的生产； 基因工程为代表的现代生物技术； 少数微生物也是人类的敌人！ 天花； 鼠疫； 艾滋病； 疯牛病； 埃博拉病毒； SARS； 禽流感； “在近代科学中，对人类福利最大的一门科学， 要算是微生物学了。” 微生物生物技术 微生物学基本操作技术 基本操作技术1：培养基的制备 培养基 为人工培养微生物而制备、提供微生 物以合适营养条件的基质。 培养基成分 微生物的生长需要有碳源、氮源、无机盐、 生长因子等营养物质。 碳源为微生物营养提供所需的碳架和能源来 源，主要有葡萄糖、淀粉、CO2等。 氮源为微生物提供所需氮素的营养来源，主 要有蛋白胨、硝酸盐、铵盐、分子态氮等。 无机盐为微生物提供除碳、氮源以外的各种 元素，主要有KH2PO4 、MgSO4、NaCl、CaCl2等。 生长因子为微生物生长提供不可缺少的微量 有机物质，主要有维生素等。 配制培养基的原则 1.根据不同微生物类型配制不同的培养基。 培养细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的培养基是不同的。 细菌 采用牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 3 g; 蛋白胨 5 g; 水 1 000 mL; pH 7.2～7.4 放线菌 采用高氏1号培养基 可溶性淀粉 20 g; KNO3 1 g; K2HPO4 1 g; MgSO4·7H2O 0.5 g; NaCl 1 g; FeSO4·H2O 0.01 g; 水 1 000 mL; pH 7.2～7.4 酵母和霉菌 采用察氏培养基 蔗糖 30 g; NaNO3 3 g; KCl 0.5 g; K2HPO4 1 g; FeSO4·H2O 0.01 g; MgSO4·7H2O 0.5 g; 水 1 000 mL; pH 6.0 培养不同营养类型的微生物也各有不同的培养基。 2.注意各种营养物质的浓度与配比。 3.控制培养基的条件（pH、O2和CO2、螯合剂等）培养 基。 pH 控制在一定的范围之内，通常在培养基里加 一些缓冲剂，如K2HPO4、 KH2PO4等。 4.选择培养材料注意经济节约,价廉物美。 培养基的类型和应用 按培养基的成分 ① 合成培养基: 顺序加入准确称量的高纯化学试剂与 蒸馏水配制而成，组成成分精确，重复性强。 ② 天然培养基: 采用动植物组织或微生物细胞或它们 的提取物或粗消化产物配制成的，其所用物质的成分 不稳定，因而营养成分难控制，重复性差。 ③ 半合成培养基: 用纯化学试剂和天然物质配成。 按培养基的物理状态 ① 固体培养基: 加了凝固剂后制成的呈固体状态的 培养基。常见的凝固剂是琼脂(约2%)或明胶(5%～ 12%)。 ② 液体培养基: 呈液态的培养基。 ③ 半固体培养基: 液体培养基中加0.5%或更低浓度 的琼脂就制成柔软的浆糊状半固体培养基。 按培养基的用途分为 ① 加富培养基: 在普通培养基里加进血、血清、动物(或植物) 组织液或其他营养物质(或生长因子)的一类营养丰富的培养基, 用以培养某种或某类营养要求苛刻的异养微生物。 ② 选择培养基: 根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要或 对某种化合物的敏感性不同而设计出来的培养基，可以将某种或 某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。 ③ 鉴别培养基: 在培养基中添加某种营养物质或化学物质(指示 剂或抑制剂)而将目的或对象微生物的菌落与同一平板上的其他 微生物菌落区别开来的培养基。如伊红美蓝培养基(EMB培养基) 可鉴别肠道杆菌中的某些细菌。大肠杆菌在此培养基上形成有绿 色金属闪光的深紫色菌落。其培养基成分为: 蛋白胨 10 g，伊 红Y 0.4 g，乳糖 5 g，美蓝 0.065 g，蔗糖 5 g，K2HPO4 2 g， 水 1 000 mL，pH 7.2 常用培养基配方 1、牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g,琼脂20g, 水1 000mL，pH7.0～7.2。常用于培养细菌。 2、高氏1号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaC1 0.5g， K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂 20g，水1 000mL，pH7.2～7.4。常用于培养放线菌。 3、察氏培养基：蔗糖30g，NaNO3 2ｇ，K2HPO4 1g，KC1 0.5ｇ MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂 20g，水1 000mL pH6.7。常用于培养霉菌。 4、马铃薯培养基（PDA） ：马铃薯200ｇ，蔗糖（或葡萄糖）20ｇ，琼 脂20ｇ，水1 000mL， pH 6.5（或自然）。常用于培养酵母菌、霉菌、 食药用菌。 牛肉膏蛋白胨培养基制作流程： 计算用量－－称量－－溶解－－调pH －－过滤－－分装三角瓶－－包扎－－灭 菌（ 121 0C, 30min）－－倒平板。 马铃薯葡萄糖培养基（PDA）制作流程： 马铃薯去皮、切粒→煮8-10分钟后取 汁使用→加药品溶化→琼脂溶化→混合定 容→调节pH值→分装→灭菌→倒平板。 高压蒸汽锅的使用 高压蒸汽锅法是实验室及生产中最常用的灭菌方 法。使用高压锅时，要注意完全排除锅内的冷空气， 使之充满饱和蒸汽，否则会因蒸汽中混有空气而比相 应纯蒸汽的温度降低，影响灭菌效果。 基本操作技术2：无菌操作 无菌操作 为了防止其他微生物进入机体或物体造成 污染，在制备培养基、使用接种箱及无菌室、 接种、分离和培养微生物时，都要进行无菌操 作。 无菌操作技术主要有：培养基用高压蒸汽 灭菌（0.1MPa，121℃，15-30min）；无菌室、 接种箱、超净工作台等用紫外线灭菌（照射 30min）；接种环、接种针用火焰灼烧灭菌； 接种需在酒精灯火焰旁的无菌区进行，接种过 程中的无菌操作。 高温灭菌方法 1、干热灭菌 （1)焚烧灭菌法（incineration）：用火焰焚烧。 （2)烘箱热空气法：常用烘箱160℃处理2小时以上。 2、湿热灭菌 （1)水煮沸法：水煮沸100℃，15分钟以上。 （2)高压蒸汽锅法（autoclaving）：高压锅 （0.1013MPa或1.05㎏/cm2 或15磅/英寸2 ）121℃处理 15～30分钟 。 （3)间歇灭菌法(tyndallization) : 100℃处理15-30 分钟，再置于28～37℃下，如此反复三次。 （4)巴斯德消毒法（pasteurization)：71.6℃处理15 分钟或62.9℃处理30分钟。 接种类型：斜面菌种；液体接种；穿刺接种 基本操作技术3： 微生物分离培养技术 微生物分离纯化 在自然界，各种微生物常常混生在一起。为了 利用某种微生物，必须将这种微生物从混杂群 体中分离出来，在适合的营养和生长条件下培 养，产生大量的个体。 微生物的观察 微生物个体微小，其个体形态一般需用显微镜才能看到。 单个微生物细胞在适宜的固体培养基表面或内部生长繁殖，会 形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，称为 菌落（colony）。 当固体培养基表面众多菌落连成一片时，则称为菌苔（lawn）。 不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔在大小、形 状、光泽度、颜色、质地、硬度、边缘情况、透明度等方面具 有不同的特征，是微生物分类鉴定的重要依据。如细菌菌落具 有湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易挑取、质地均匀和颜色 一致等特征，霉菌、放线菌等微生物的菌落也具有各自相应的 特征。 在生产中，我们往往只需要某一种微生物，可采用涂布平板、 平板划线等方法获得这种微生物的菌落。 用固体培养基分离方法： 1. 涂布平板法 2. 平板划线法 3. 稀释倒平板法 分离纯化操作步骤： 1.用涂布平板法从土壤中分离细菌：制土壤菌悬液— —涂布分离——倒置培养 2.用平板划线法从腐烂水果中分离酵母和霉菌 细菌菌落的分离要使用平板，而不采用斜面。 涂布平板分离法和平板划线分离法为什么能分离 出细菌的单菌落？ 如果进行分区平行划线，细菌单个菌落最可能出 现在哪一个区？如果进行连续画线，细菌单个菌 落最可能出现在什么区域？ 在平板划线分离操作中，每次划平行线前都必须 烧掉接种环的剩余物。 平板倒置培养。 微生物分离培养技术活动拓展 学习了细菌菌落的分离和培养后，请设计实验 方案，从自然环境分离并培养与人类生活关系 密切的其它微生物（如酵母菌、霉菌等）菌落。 （可根据生活环境寻找特定的微生物。酵母菌 喜欢生活在含糖高的环境，霉菌多生长在偏酸 的环境，如水果、蔬菜的表面及其栽培土壤 中。 ） 基本操作技术4：培养基对微生物的选择 作用 培养基对微生物的选择作用 如果我们所需的微生物在样品中的数量很少， 直接采用涂布平板法、平板划线法就很难分离出来。 为此，我们可以根据不同的微生物对营养物质（碳 源、氮源、生长因子等）、理化因素的不同要求， 设计出不同的培养基以抑制不需要的微生物的生长， 促进所需微生物的生长。例如，要从土壤中分离获 得自生固氮菌时，常采用无氮源的培养基进行培养， 可以抑制其他非固氮微生物的生长，从而将自生固 氮菌分离出来。 利用培养基选择培养所需的微生物 在自然界混杂的微生物群体中，如果所需的某种微 生物只占少数，但其生长要求是已知的，那就可制 作一种特别适合于这种微生物生长的培养基，从而 把它选择培养出来。 选择培养方法主要有： （1）采用加富培养基进行选择。加富培养基就是在 培养基中加入所需微生物特别需要的某一营养物质， 使它们的数量增加，以达到选择目的而设计的培养 基。自然界中数量较少的微生物采用这种方法，可 使该微生物大大增殖，在数量上超过原有占优势的 微生物，以达到加富培养的目的。用于加富的营养 物质通常是所需微生物专门需要的碳源或氮源。例 如，筛选纤维素分解菌可用纤维素，加富酵母菌可 用较浓的糖液。 （2）用化学物质进行选择。不同的微生物对某种化 学物质或者理化因素的反应不同，依此设计培养基并 经培养后，所需微生物可大大增殖，使之在数量上占 优势，而其他微生物的生长受到抑制，从而达到选择 培养的目的。 化学物质常有染料（ 结晶紫等）、 抗生素等， 理化因素常有温度、氧气、pH值等。例如，分离某种 抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的培养基上分离。 土壤是分离微生物最好的菌源材料 土壤是微生物生活最适宜的环境，它具有微 生物所需要的一切营养物质和微生物进行生长繁 殖的各种条件，因此，土壤具有“微生物天然培 养基”之称，这里的微生物数量最大，类型最多， 包括有细菌、放线菌、真菌等类群，是最丰富的 “菌种资源库”。 基本操作技术5：微生物数量测定 测定微生物的数量 一方面，在利用微生物发酵生产食品、饮料等 产品的过程中，要通过测定微生物的数量来观察产品 是否达到质量要求，如酸奶的生产中，为了检测产品 中乳酸细菌数量是否达到产品标准，需进行细菌数量 的测定； 另一方面，在食品、饮用水、生物医药制品的 生产中，为防止病原微生物危害，需要检测微生物数 量以评估其卫生程度，如饮用水常通过检测微生物的 数量来监测其水质。 微生物的数量测定方法： 血球计数板计数 平板菌落计数 血球计数板计数 图1 血球计数板构造 图 2 血球计数板构造 A. 正面图；B.纵切面图 放大后的方格网，中间大方格为计数室 1. 血球计数板；2. 盖玻片；3.计数室 血球计数板 血球计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定 的计数室，其面积为１mm2，高为0.1mm，在１mm2的面 积里又被刻划成25个（或16个）中格，每个中格再划分 成16个（或25个）小格，计数室都是由400个小格组成。 其血球计数板法的计数方法为：将稀释的样品滴在 血球计数板上，在显微镜下计算计数室中的５个中格 (一般选4个角和中央的一个中格)的总菌数（A），按下 面公式求出每毫升样品所含的菌数。每毫升样品所含菌 数＝A/5×25（或16）×10 000×稀释倍数。 但此法不能区分死菌与活菌，所得结果是包括死菌 在内的总菌数。 平板菌落计数 平板菌落计数法为一种活菌计数法。方法的原 理是将样品适当稀释接种在平板上，培养后可形成 菌落，一个菌落一般来源于一个细胞，统计菌落数 即可知样品的活菌数。 平板菌落计数法能测出样品中的活菌数，现仍 是生产上常用的一种测定菌数的有效方法，广泛应 用于微生物数量的检测。但该法较为耗时，需要培 养一段时间才能取得结果。 比较血球计数板法和平板菌落计数法的优 缺点。 说明用血球计数板法计数时造成误差与哪 些因素有关？ 微生物数量测定活动拓展 学习了计数土壤中细菌数量的方法，请尝 试设计实验方案，测定其他环境中微生物的数量， 如自来水、池塘水、空气、酸奶、干酵母粉等。 微生物生物技术的应用 微生物技术在工业上的应用 微生物技术在医药上的应用 微生物与人类健康 生物制品（菌苗、疫苗等），微生物代谢产物 （抗生素、维生素、酶等），由遗传工程菌生产的 各种药物如胰岛素、干扰素、白细胞介素，微生物 生物转化形成的甾体激素类药物。 微生物技术在农业上的应用 食药用真菌 微生物肥料（细菌肥料、5406抗生菌肥料、复合微生 物肥料、菌根菌肥等） 微生物农药（细菌杀虫剂、真菌杀虫剂、病毒杀虫剂、 农用抗生素等） 微生物饲料（单细胞蛋白和菌体蛋白饲料、秸秆饲料、 藻类饲料、微生物饲料添加剂） 食药用真菌 杏鲍菇 白灵菇 秀珍菇 鲍鱼菇 杏鲍菇 金针菇 平菇 茶树菇 尖顶羊肚菌 松 茸 猴头菇 毛木耳 灵芝 虫草 蛹虫草 香菇 云芝 双孢蘑菇 草菇 竹荪 大秃马勃 印度块菌 微生物肥料 是将某些有益微生物经大量人工培养制成的生物肥料， 又称菌肥、菌剂、接种剂。 根瘤 微生物农药 棉铃虫幼虫的环节处被核型多角体病毒感染. 微生物农药 微生物杀虫剂(苏云金芽孢杆菌) 微生物杀菌剂 微生物除草剂 微生物杀鼠剂 微生物植物生长调节剂 微生物在环境保护中的作用 微生物对农药的降解 微生物对有毒元素的转化 微生物降解生活污水、工业污水和生活垃圾等 。 微生物对合成聚合物的降解 微生物生态环境保护剂 利用微生物生产易降解的医用塑料、快餐盒； 废水的微生物处理 微生物与污水处理 污水处理的方法有物理法、化学法和生物法。各种方法都有其特点， 可以相互配合、相互补充。目前应用最广是生物学方法，其优点是效率高、 费用低、简单方便。 好氧生物处理 微生物在有氧条件下，吸附环境中的有机物，并将有机物氧化分解成无机 物，使污水得到净化，同时合成细胞物质。微生物在污水净化过程，以活性污 泥和生物膜的主要成分等形式存在。 活性污泥法（activated sludge process） 又称曝气法。是利用含有好氧微生物的活性污泥 ，在通气条件下，使污水净 化的生物方法。该法已成为处理有机废水的最主要的方法。 在污水处理过程中，活性污泥具有很强的吸附、氧化和分解有机物的能力。 在静止状态时，又具有良好的沉降性能。它是一种特殊的、复杂的生态系统， 在多种酶的作用下进行着复杂的生化反应。活性污泥中的微生物主要是细菌， 占微生物总数的90%～95%。 曝气生物滤池法 占地面积小，基建投资省，出水水质高的特点 厌氧生物处理 厌氧生物处理是在缺氧条件下，利用厌氧性微生物（包括 兼性厌氧微生物）分解污水中有机物污染物的方法。又称厌氧 消化或厌氧发酵法。因为发酵产物产生甲烷，又称甲烷发酵。 此法既能消除环境污染，又能开发生物能源，所以备受人们重 视。 微生物对重金属的转化 自然界存在多种重金属，例如，汞、砷、 铅、镉、铬等，这些重金属并非生物生活所必 需，但达到一定浓度时，会对生物产生抑制和 致死作用。 微生物对重金属的吸附 环境保护，去除环境 中污染的重金属 回收昂贵或战略性的 稀有金属 微生物与石油污染 微生物降解 微生物与环境监测 环境监测 包括环境分析、物理测定和生物监测。所谓生物 监测就是利用生物对环境污染所发生的各种信息作为判断环境污 染状况的一种手段。生物长期生活在自然界中，不仅可反映出多 种因子污染的综合效应，而且也能反映环境污染的历史状况。故 生物监测可以弥补物理、化学分析测试的不足，特别是微生物， 与环境关系极为密切，因此微生物学方法在环境监测中占有特殊 的地位。 粪便污染指示菌 粪便污染指示菌的存在，是水体受过粪便污染的指标。根 据对正常人粪便中微生物的分析测定结果，采用大肠菌群及粪 链球菌作为指标较为合适，其中以前者较为广用。 大肠菌群（coliform group， 简称coliform）是指一大群 与大肠杆菌相似的好氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌， 它们能在48小时内发酵乳糖产酸产气，包括埃希氏菌属、柠檬 酸杆菌属（Citrobacter）、肠杆菌属（Enterbacter）、克雷 伯氏菌属（Klebsiella）等。检测水体中总大肠菌群的方法主 要是MPN(most probable number）试验法，即发酵法和滤膜试 验法。 大肠菌群数量的表示方法有两种，其一是"大肠菌群数"，亦称 "大肠菌群指数"，即1L水中含有的大肠菌群数量。其二是"大 肠菌群值"，指水样中可检出一个大肠菌群数的最小水样体积 （mL） 。 微生物学发展趋势 研究向纵深和分子水平发展 自1990年代以来，由于“人类基因组计划”推动，促进微 生物学发展： 微生物基因组学 微生物信息学 微生物分子进化学 微生物功能基因组学 微生物结构生物学 微生物蛋白组学 后基因组生物学时代的到来 微生物学分支学科特点 交叉性强：微生物进化工程学、细菌冶金学 自觉度高：微生物的基因工程、生化工程、细胞工程、 蛋白质工程、代谢途径工程和抗体工程等。 覆盖面广：工业、农业、医药、环保和国防等。 在微生物学发展中有重要贡献的人 物 吕文虎克（Antony van Leeuwenhoek）（荷兰，1632-1723） 列文虎克利用业余时间制造过400多架 单式显微镜和放大镜，放大率一般为50~200倍， 巴斯德（Louis Pasteur)（法国， 1822-1895） 科赫（Robert Koch) （德国，1843-1910） 贡献： 1、建立微生物学研究 技术 （1)分离和纯化细菌 （2）细菌的固体培养 基 2、染色技术 3、证实病害的病原菌 学说 弗莱明，Alexander Fleming，英国，1881-1955 李斯特（Lister)（英国） 手术消毒技术 梅契尼科夫 （Metchnikoff） （俄国） 免疫学，强身抗菌； 微生物防害虫。 贝哲林克 （Beijerinck) （荷兰） 根瘤菌和土壤固 氮菌 维诺格拉德斯基 （Winogradsky)（俄国） 硝化细菌 伊万诺夫斯基 （D.Ivanovski) （俄国） 病 毒 W . M. Stanley （美国） 谢谢！