Transcript wykład 6-online

Podsumowanie
1. Wirusy jako wektory
2. Ekspresja przejściowa z wykorzystaniem wektora wirusowego
3. Przykłady wirusów roślinnych funkcjonujących jako wektory:
• Wirus mozaiki stokłosy BMV
• Wirus tytoniu TRV
4. Wyciszanie genów przy pomocy wirusa TRV
5. Geny markerowe w konstrukcie genowym
• Geny selekcyjne
• Geny reporterowe
6. Cechy genu reporterowego
7. Białka reporterowe i ich zastosowanie ( GUS, GFP, lucyferaza)
8. Techniki wykrywania GMO
• PCR
• Immunodetekcja ( ELISA)
• Obecność terminatora
• Odporność na antybiotyki i herbicydy – przykłady
• Detoksykacja
• Stymulacja rozwoju in vitro
• Modyfikacja węglowodanów
Wirusy jako wektory
Ekspresja przejściowa – wprowadzenie genu do ukształtowanego organizmu i
dostarczenie go do wielu komórek i tkanek za pomocą zmodyfikowanych wirusów.
+Łatwość infekcji
+Duża ilość wbudowywanych kopii = wysoka ekspresja wprowadzanych genów
+Dowolny moment infekcji podczas rozwoju rośliny
- Limitowana wielkość wprowadzanego DNA (0,8 kpz)
- Infekcja wirusowa może być letalna dla komórek gospodarza
- Błędna synteza wirusowego RNA = błędna ekspresja wprowadzanych genów
Przejściowa ekspresja obcych genów przy użyciu
wektora wirusowego
Możliwość produkcji dużej ilości białek (synteza produktu z obcego genu
0,4-2% rozpuszczalnych białek rośliny).
Wyciszanie genów metodą VIGS (Virus Induced
Gene Silencing)
Wirus TRV tytoniu z dwudzielnym genomem: RNA1 i RNA2;
• RNA1 – zawiera replikazę, sekwencję kodującą movement protein i białko
bogate w cysteinę
• RNA2 – białka płaszcza i dwa białka strukturalne, które nie są niezbędne do
funkcjonowania wirusa;
W miejsce sekwencji kodującej białko strukturalne wstawiono fragment z miejscami
restrykcyjnymi do klonowania obcego DNA;
Mieszaniną komórek bakteryjnych Agrobacterium z TRV- RNA1 i TRV-RNA2
infekowano liście pomidora, a odtworzony wirus rozprzestrzeniał się i przenosił
sekwencję wprowadzoną w jego MCS.
*Wyciszenie genu syntazy fitoenu – kluczowego enzymu syntezy karotenoidów
Geny markerowe
Geny markerowe
Geny selekcyjne
Geny reporterowe
ułatwiają szybkie rozpoznanie transformantów i zmniejszają
ryzyko regenerowania roślin mozaikowych zawierających
komórki stransformowane i nie transformowane;
1. Geny selekcyjne
2. Geny reporterowe
nadają komórkom zdolność do podziałów i regeneracji roślin na
pożywce zawierającej antybiotyk (zwykle kanamycynę lub
higromycynę) lub herbicyd (zwykle preparaty Basta lub Round-up) i
w związku z tym toksycznej dla komórek dzikiego typu (nie
transformowanych).
geny reporterowe, zwane też wizualizującymi, powodują zmiany w
wyglądzie i składzie chemicznym roślin - zwykle gromadzenie jakiegoś
barwnika (tak działa gen β-glukuronidazy czyli GUS) lub świecenie
(geny lucyferazy z bakterii - LUX lub owadów świetlików - LUC
Przykłady genów reporterowych
Gen
Białko - produkt genu Katalizowana reakcja
Pochodzenie genu
Metoda analizy
GUS (uidA)
Escherichia coli
hydroliza
spektrofotometryczna
glukuronidów np.: X- , fluorymetryczna,
Gluc
histochemiczna
LUC (luc)
lucyferaza
Photinus pyralis
Utlenianie lucyferyny
zależne od ATP;
luminometryczna,
towarzyszy mu emisja fotoluminescencyjna
światła
GFP (gfp)
Białko zielono
fluoryzujące
Aequorea victoria
CAT (cat)
acetylotransferaza
chloramfenikolu
Escherichia coli
Proces fluorescencji
Acetylacja
chloramfenikolu
fluorymetryczna,
mikroskopia
fluorescencyjna
Obraz ekspresji
niebieski barwnik
żółto-zielone
świecenie własnym
światłem
zielone świecenie
obiektów
oświetlonych
niebieskim lub
nadfioletowym
światłem
chromatografia
pojawienie się
ciekowarstwowa,
produktów acetylacji
autoradiografia,
antybiotyku na
spektofotometryczna, chromatogramie (a
densytometryczna,
dokładniej na
autoradiogramie)*
Techniki detekcji GMO
1. PCR – analiza kwasów nukleinowych (materiał świeży całe rośliny, organy)
2. Immunodetekcja - analiza produktów białkowych transgenu (materiał
przetworzony); ELISA- test immunoenzymatyczny (ang. enzyme linked
immunosorbent assay)
3. Obecność terminatora np. E9 3’ z genu małej podjednostki Rubisco z grochu,
terminator genu syntazy nopalinowej z Agrobacterium
4. Analiza odporności na antybiotyki lub herbicycy np. gen bla –kodujący βlaktamazę zapewniającą odporność na ampicylinę i penicylinę,
gen Tn5 – kanamycynę;
bar/pat- acylotransfereza fosfinotrycyny – nadaje odporność na wiele herbicydów
np. Basta, Ignite, Liberty.
Selekcja GM na podstawie detoksykacji
Geny kodujące enzymy zdolne do przekształcania substancji toksycznych w ich
nietoksyczne pochodne.
DOG R1 – produkuje fosfatazę 2- deoksyglukozylo-6-fosforanową, która
katalizuje przemianę szkodliwego dla roślin fosforanu 2-deoksyglukozy w 2deoksygukozę
Modyfikacja węglowodanów
Wykorzystanie do selekcji węglowodanów:
Gen izomerazy fosfomannozy pmi- umożliwia zmianę 6-fosforanu mannozy
do 6 fosforanu glukozy, który jest łatwo metabolizowany przez rośliny.
Selekcję opartą na wprowadzeniu genu pmi zastosowano u roślin jedno i
dwuliściennych (pszenicy, kukurydzy, buraku cukrowym, ogórku i drzewach
owocowych)
xylA- katalizuje przekształcenie ksylozy w D-ksylulozę, która może być
wykorzystana jako źródło C przez komórki roślinne; selekcja z
wykorzystaniem ksylozy sprawdziła się u tytoniu, pomidora i ziemniaka, a
wydajność transformacji była wyższa niż przy użyciu wektora z genem nptII.