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第四章 药物定量分析与分析方法验证 第一节 定量分析样品前处理方法 概述 含金属与卤素药物须处理后进行测定。处理方法视 结合牢固程度而异。卤素与芳环相连牢固；与脂肪 族碳相连，结合不牢固。含金属药物：金属不直接 与碳相连为含金属的有机药物，不牢固，一般直接 测定；金属与碳相连为有机金属药物，须适当处理。 不经有机破坏的分析方法 经有机破坏的分析方法 含卤素有机药物的分析 含卤素有机药物系指药物分子结构中所 含卤素直接与芳环或脂肪链相连者，而不包括 某些有机药物的卤酸盐或氢卤酸盐 结构特点：C—X 卤原子的活泼性 1. 卤原子与碳原子直接相连，卤原子的活泼性 和它直接相连的烃基的结构有很大关系 乙烯型卤和芳卤 CH2 CH X 不活泼 X 烯丙型卤和苄卤 活泼 CH2 CH CH2 X （3）卤代烷型 CH2X 介于两者之间 CH2 CH (CH2)n X n¡Ý2 分子中所含卤原子的个数 分子中所含卤原子的个数越多，活泼性 越强，特别是同一碳上含多个卤原子或一个苯 环上含多个卤原子时，活泼性增强更加明显 含卤素有机药物的分析 适当的处理 C X X 直接回流后测定法 碱性或酸性还原后测定法 氧瓶燃烧分解后测定法 共性：卤素原子与碳相连结合的位置不同， 结合的牢固程度不同，故在样品预处理时根据 卤素与药物结合状态的不同，采取不同的样品 处理方法将有机结合的卤素转变为无机的卤离 子，再选用适宜的分析方法。 一、不经有机破坏的分析方法 直接测定法-键结合不牢固的有机金属药物，如富 马酸亚铁中铁的测定。 水解后测定法-有机卤素药物中卤素与C结合不牢 固药物。本类药物的分析特点是通过测定含卤素 的量来计算药物的含量 。 1、直接测定法 金属元素不直接与碳原子相连的含金属有机药物或 C-M键结合不牢的有机金属药物，在水溶液中可电 离，不须破坏直接采用适当的方法测定 如葡萄糖酸钙中的钙离子-EDTA络合滴定 2、经水解后测定法 方法原理（卤素）：将含卤素的有机药物溶于适 当溶剂中，加氢氧化钠或硝酸银溶液加热回流使 其水解，将有机结合的卤素，经水解作用转变为 无机卤素离子，然后采用间接银量法测定。如三 氯叔丁醇的测定。 间接银量法：定量加入过量的AgNO3 ，以硫氰 酸铵为滴定剂，以硫酸铁铵为指示剂滴定过量的 硝酸银。 CCl3C(CH3)2OH + 4NaOH 回流 △ (CH3)2CO + 3NaCl + HCOONa + 2H2O NaCl + AgNO3 AgCl↓ + NaNO3 (Ksp=1.56×10–10 ) AgNO3 + NH4SCN AgSCN ↓ + NH4NO3 (Ksp=1.0×1012 ) Fe3+ + SCNˉ Fe (SCN) 2+ （淡棕红色） 硫酸水解后测定法：硬脂酸镁加定量过量硫酸使 药物水解，过量硫酸用氢氧化钠滴定。 3、经还原后测定法 碱性还原后测定 方法原理；在氢氧化钠和锌粉存在的条件下，使 有机药物（多用于含碘有机药物）加热回流，发 生还原裂解反应，使有机结合的卤素（碘）转变 为无机卤素离子（碘离子），继而采用间接银量 法或其他方法进行测定，如泛影酸的测定。 适用范围：碘原子与苯环直接相连的药物。 例 泛影酸的测定 取本品约0.4g，精密称定，加氢氧化钠溶液30ml 与锌粉1.0g，加热回流30min，放冷，冷凝管用少量 水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤3次，每次15ml， 洗液与滤液合并，加冰醋酸5ml与曙红钠指示液5滴， 用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸银滴定液 (0.1mol/L)相当于20.46mg的C11H9 I 3N2O4。 COOH I I + 11NaOH + Zn H3COCHN NHCOCH3 I COONa 回流 △ + 3NaI + 2CH3COONa H2N N H2 + 2Na2ZnO2 + H2O 酸性还原后测定法 方法原理；在醋酸和锌粉存在的条件下，有机 药物（多用于含碘有机药物），发生还原裂解 反应，使有机结合的卤素（碘）转变为无机卤 素离子（碘离子），采用银量法测定卤素离子 的含量。 二、经有机破坏的分析方法 （一）、湿法破坏 硝酸-高氯酸法：破坏能力强，反应激烈，需防止 爆炸。适用于生物样品的破坏，所得的无机金属 离子为高价态。 硝酸-硫酸法：适用于与碳原子结合牢固的绝大多 数含金属有机药物的破坏分解（但不适用于含碱 土金属类有机药物），所得的无机金属离子为高 价态。 硫酸-硫酸盐法：常用的硫酸盐为硫酸钾，所得的 无机金属离子为低价态。常用于含砷或锑有机药 物的破坏分析。 凯氏定氮法-含氮有机药物定量分析方法 原理：常用凯氏定氮法测定天然有机物(如蛋白质、 核酸及氨基酸等)的含氮量。含氮的有机物与浓硫酸 共热时，其中的碳、氢元素被氧化成二氧化碳和水， 而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。 浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水 蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量的硼酸溶液中，硼酸 吸收氨后用标准无机酸滴定，最后根据所用标准酸 的摩尔数计算出待测物中的总氮量。 CH2NH2COOH+3H2SO4 2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 +2NaOH NH3+H3BO3 2CO2+3SO2十4H2O十NH3 (NH4)2SO4 2NH3+H2O+Na2SO4 NH4BO2+H2O NH4BO2+H2SO4+2H2O (NH4)2SO4 +2H3BO3 （直接滴定法） 还可用剩余滴定法或甲醛法滴定 消解时通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应 液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反 应的进行。对某些难以分解的药物（如含氮杂环 结构药物），在消解过程中常还需加入辅助氧化 剂，以使分解完全并缩短消解时间。常用的辅助 氧化剂有过氧化氢和高氯酸，但需慎用。 某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所 含氮的g数来表示(％)。因此在定氮前，应先将固体 样品中的水分除掉。若样品为液体(如血清等)，可取 一定体积样品直接消化测定。 常量法取供试品的量约相当于含氮量25~30mg，半 微量法供试品取样量约相当于含氮量1.0~2.0mg。 中国药典用本法测定含有氨基或酰胺结构的药物含 量。对于以偶氮或肼等结构存在的含氮药物，因在 消解过程中易于生成氮气而损失，须在消解前加锌 粉还原后再依法处理；而杂环中的氮因不易断键而 难以消解，可用氢碘酸或红磷还原为氢化杂环后再 行消解。对于含氮量较高的样品（超过10%），可 在消解液中加入少量多碳化合物，如蔗糖、淀粉等 作为还原剂，以利于氮转变为氨。 （二）、干法破坏 1、高温炽灼法 将有机物灼烧灰化以达分解的目的。将适量样品 置于瓷坩埚或铂坩埚中，加入无水碳酸钠、氢氧 化钙或轻质氧化镁等以助灰化，混匀后，先小火 加热使样品完全炭化，然后高温灼烧，使其完全 灰化。 本法适用于湿法不易破坏完全的药物以及不能用 硫酸进行破坏的有机药物。 2、氧瓶燃烧法 系指将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中 进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适 当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用 适宜的分析方法进行鉴别，检查或含量测定。 点燃 C Cl O 2 HCl NaOH溶液 NaCl 适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析 本法简便、快速、破坏完全，尤其用于微量样品分析 基本原理 有机物 充O2烧瓶 燃烧 产物 吸收液 →分析 仪器装置和设备 （1）燃烧瓶 （2）称样材料及称样方法 无灰滤纸：适用于固体；纸袋：适用于液体 （3）氧气：采用钢瓶氧气,防止导气管污染。 （4）吸收液 作用：定量吸收供试品的燃烧分解产物，使其转变 为便于测定的价态。 选择原则：被测物质的种类及所用分析方法 药物 含氟 破坏后 氟化氢 吸收液 水 定量方法 含氯 氯化氢 NaOH水溶液 银量法 含溴 溴+溴化氢 银量法 含碘 各种价态碘 含硫 三氧化硫 NaOH水溶液 +还原剂SO2 NaOH水溶液 +还原剂SO2 H2O2溶液 含磷 五氧化二磷 水 磷钼蓝比色法 含硒 四价硒+少量六价硒 硝酸溶液 二氨基萘比色 法 硒素氟蓝比色 法 银量法 重量法 3、注意事项： （1）燃烧瓶：大小适宜、干净、有防爆措施 （2）氧气要充足：燃烧完全（不得有黑色炭化物） （3）产生烟雾应完全被吸收：充分振摇 烟雾颜色：碘，紫色；溴，红棕色；氟、氯,白 （4）测定氟化物：石英制燃烧瓶 待分解样品量 3~5mg（微量分析） 20~30mg（半微量分析） 50~60mg 0.6~0.7g或更多 燃烧瓶的体积 150~250ml 300~500ml 1000ml 2000ml或特殊结构 的燃烧瓶 正确选用燃烧瓶的目的在于：样品能 在足够的氧气中燃烧分解完全；有利于将 燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中；防 止爆炸的可能性。 第二节 定量分析方法特点 一、容量分析法 （一）容量分析法的特点 操作简单、快速； 比较准确（RSD＜0.5%）； 仪器普通易得。 （二）容量分析法的计算问题 1. 滴定度（T）的概念 每1ml滴定液相当于被测物质的量(mg) 2. 滴定度的计算 aA + bB cC + dD T = M×a/b×B 3. 百分含量的计算（原料药） （1）直接滴定法 D% = V ×F × T/W ×100% F = 实际标定的浓度/规定的浓度 （2）剩余滴定法 T（V V）F 百分含量 % ms T——滴定度，每1ml滴定液相当于被测组分的mg数 V——滴定时，供试品消耗滴定液的体积（ml） V0——滴定时，空白消耗滴定液的体积（ml） F——浓度校正因子 ms——供试品的质量 双相滴定法测定苯甲酸钠含量。取本品0.3220g, 加水15ml，乙醚30ml与甲基橙3滴，用 0.1062mol/L盐酸滴定，至水层显橙红色，分取 水层，置具塞锥形瓶中，加乙醚20ml，振摇， 继续滴定至持续橙红色，消耗盐酸体积21.05ml。 计算样品中苯甲酸钠含量。苯甲酸钠分子量 144.1。 司可巴比妥的含量测定：取供试品0.1301g，置碘量瓶 中，加水10ml，振摇使溶解，精密加溴滴定液 （0.1mol/L)25ml，再加盐酸5ml，立即密塞并振摇1min， 暗处静置15min后，加碘化钾试液10ml，立即密塞摇匀， 用0.0999mol/L硫代硫酸钠滴定液滴定，至近终点时加 淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用 空白试验校正。已知：样品消耗硫代硫酸钠滴定液 15.05ml，空白消耗25.05ml，每ml溴滴定液（0.1mol/L) 相当于13.01mg的司可巴比妥。计算含量 片剂含量测定结果的计算 每片含量 标示量 % 100 % 标示量 测得量（ g） 平均片重（ g） 供试品重（ g） 100 % 标示量（ g / 片） TVF 平均片重 ms 标示量 % 100 % 标示量 烟酸片含量测定 取本品10片,精密称定为3.5840g,研细,精密称取 0.3729g,置100 mL锥形瓶中,置水浴加热溶解后,放冷. 加酚酞指示剂3滴,用氢氧化钠滴定液 （0.1005mol/L),滴定至粉红色,消耗25.02 mL.每1mL 氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当12.31mg的烟酸. 求 供试品中烟酸的标示百分含量（标示量0.3g/片） V × T × F ×平均片重 ×100 % 标示量%= W ×标示量 = 25.02 ×12.31/1000 ×0.1005/0.1×0.3584 ×100 % 0.3729 ×0.3 = 99.17% 二、光谱分析法 （一）紫外-可见分光光度法（200nm～760nm) 灵敏度高，可达10-4g/ml ～ 10-7g/ml 1. 特点 准确度高，RSD（%）为2% ～5% 仪器价格低廉操作简单，易普及，应用广 2. 定量：朗伯-比耳定律 A = E1%1cmCL 3. 仪器校正和检定 波长校正用汞灯中较强谱线237.38,253.65,275.28,296.73, 313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm与576.96nm 或用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm进行校正。 吸收度的检定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/LH2SO4液至1000ml 波长(nm) E1%1cm 235(最小) 124.5 杂散光检查： 试剂 NaI NaNO2 257(最大) 313(最小) 350(最大) 144.0 48.62 106.6 浓度(g/ml) 测定波长 透光率(%) 220nm ＜ 0.8 340nm ＜ 0.8 1.00 5.00 4. 对溶剂的要求: 220～240nm 241～250nm 251～300nm 300nm以上 溶剂+吸收池A ＜0.41 ＜0.20 ＜0.10 ＜0.05 5. 测定方法 要求供试品溶液的A应在0.3 ～0.7 对照品比较法：Cx=(Ax/Ar)Cr; 含量%=Cx×D/W×100 % 常用方法 吸收系数法： 含量%= (E1%1cm )x/(E1%1cm )r ×100 % 计算分光光度法：VA的三点校正法 比色法 定量计算方法（1）对照法 A供 A对 A供 A对 1% E1cm c供 l 1% E1cm c对 l c供 c对 c供 c对 A供 A对 硫喷妥钠的含量测定：取供试品0.2500g，用水稀释 至500ml，精密取1ml用0.4%NaOH溶液定量稀释至 100ml，作为供试品溶液；另取硫喷妥对照品用 0.4%NaOH溶液配制浓度为5µg/ml作为对照品溶液。 照分光光度法，在304nm波长处分别测得供试品和 对照品的吸收度为0.520和0.545，已知1mg硫喷妥相 当于1.091mg的硫喷妥钠，试计算硫喷妥钠的含量 （2）吸收系数法 A 1% E1cm cl c(g/100ml) c(g/ml ) A 1% E1 cml A 1% E1 cml 100 A 百分含量 % Ecml ms nV % 对乙酰氨基酚的含量测定方法为 精密称取本品40.1mg，置250ml量瓶中，加0.4%氢 氧化钠溶液50ml溶解后，加水至刻度，摇匀，精 密量取5ml，置100ml量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶 液10ml，加水至刻度，摇匀。在257nm的波长处 测定吸收度为0.570，按C8H9NO2的百分吸收系数 为715计算。 （二）荧光分光光度法 灵敏度高，可达10-10g/ml ～ 10-12g/ml 在低浓度进行测定，防止F与C不成正比及自熄灭作用 1. 特点 用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减 灵敏度高，但干扰因素多。 制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和选择性。 用样品量少。 2. 荧光分析仪 有二个单色光器—激发单色光器与发射单色光 器；且激发光源、样品池和检测器成直角。 3. 含量测定 常用的方法对照品比较法: Ci = (Ri-Rib)/(Rr-Rrb) ×Cr Ch.P收载地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。 三、色谱分析法 按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱 方法分类 按分离方法分为：PC；TLC；柱色谱；GC，HPLC。 （一）HPLC法 1. 对HPLC仪器一般要求 色谱柱、流动相按品种项下要求。 色谱柱的理论板数：n = 5.54(tR /Wh/2)2 2. 系统性试验 分离度：R = 2（tR1 – tR2)/(W1 + W2); 要大于1.5 重复性：RSD≤2% 拖尾因子：T = W0.05h/2d1 应在0.95 ～ 1.05 正常峰和不正常峰如何判断？ 用拖尾因子（对称因子）：T T= W0.05h/2A T：0.95 ~ 1.05 对称峰 > 1.05 < 0.95 拖尾峰 前沿峰 内标法加校正因子测定供试品中主成分含量 3. 测定方法 标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法 含量= CR × AX AR 外标一点法：一种浓度对照物对比样品中待测组分含量 前提：截距接近0，对照品浓度与待测组分浓度接近 内标法： 过程：ms mi 混匀进样 测Ai 和As 校正因子（f）= AS/CS AR/CR 含量（CX）=f 对内标物要求： a．内标物须为原样品中不含组分 b．内标物与待测物保留时间应接近且R>1.5 c．内标物为高纯度标准物质，或含量已知物质 AX A’S/CS’ 内标法优点： 进样量不超量时，重复性及操作条件对结果无影响 只需待测组分和内标物出峰，与其他组分是否出峰 无关 。 内标法缺点： 制样要求高；须寻找合适内标物 外标法特点： 1）不需要校正因子，不需要所有组分出峰 2）结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大 →每次进样量应一致，否则产生误差 例：醋酸氢化可的松的含量采用HPLC法测定：取 本品对照品适量，精密称定，加甲醇定量稀释成每 ml约含0.35mg的溶液。精密量取该溶液和内标溶液 （0.30mg/ml炔诺酮甲醇溶液）各5ml，置25ml量瓶 中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取10ul注入液相色 谱仪，记录色谱图。另取本品适量，同法测定，按 内标法计算含量。已知：对照品取样为36.2mg，样 品取样为35.5mg，测得对照液中醋酸氢化可的松和 内标的峰面积分别为5467824和6125843，样品液中 药物和内标的峰面积分别为5221345和6122845，计 算本品的含量 第三节 药品分析方法的验证 需验证的分析项目 1. 鉴别试验； 2. 杂质定量或限度检查； 3. 原料或制剂中有效成分含量测定； 4. 制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定； 5. 溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法。 一、准确度 是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示 （一）含量测定方法的准确度 1. 原料药 可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确 度的另一方法测定的结果进行比较。 2. 制剂 要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原 料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD。 具体做法：测定高、中、低三个浓度（n=3）, 共9个数据来评 价，回收率的RSD＜2%；用UV和HPLC法时，一般回收率可达 98%～102%；容量法可达99.7%～100.3% 二、精密度 是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果 之间的接近程度。 （一）精密度表示方法 1. 偏差(deviation , d) d = 测得值-平均值=Xi-X 2. 标准偏差（standard deviation, SD或S） S =[(∑Xi – X)2/(n-1)]1/2 3. 相对标准差(relative standard deviation, RSD) RSD=标准偏差/平均值×100%=S/X ×100% （二）重复性、中间精密度及重现性 1. 重复性 在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度. 2. 中间精密度 在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不 同设备测定结果的精密度。 3. 重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。 三、专属性 是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下， 采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检 查、含量测定方法，均应考察其专属性。 （一）鉴别反应 应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分 的样品均应呈现负反应。 （二）含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。 图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能 获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂 质和降解物不能获得的情况下，可用已验证方法和药典方法进 行对照；也可用对试样加速破坏的方法进行验证。 四、检测限 是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验 指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。 （一）常用的方法 1.非仪器分析目视法 用已知浓度被测物，试验出能被可靠地 检测出的最低浓度或量。 2.仪器分析方法 GC和HPLC法： LOD = S/N = 2或3 五、定量限 是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应 具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求 LOQ. 常用信噪比法确定定量限，一般以S/N=10时，相应的浓度 进行测定。 六、线性 是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接 呈正比关系的程度。 UV法：首先制备一个标准系列，浓度点n =5; A = 0.3～0.7 建立回归方程C = aA + b ;r ＞ 0.999。 HPLC法：制备一个标准系列，浓度点n =5 ～7; 以C对h或A或与 内标物的峰面积之比，建立回归方程r＞0.999。 七、范围 是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法 适用的高低限度或量的区间。 原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的80%～ 120%。 制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的70%～ 130%。 溶出度或释放度中的溶出量测定：范围应为限度的±20%。 八、耐用性 是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受 程度。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品提取次数、 时间等。 HPLC法变动因素有：流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。 GC法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检 测器温度等。 分析方法效能指标的要求 1、非定量方法：用于鉴别试验、杂质的限量检查，只对 专属性、耐用性和检测限有要求，其余均无须要求。 2、用于原料药中主成分或制剂中有效成分含量测定及溶 出度测定，除了检测限和定量限外，其余均要求。 3、杂质测定或制剂中降解物测定：属于微量定量分析， 除检测限不必要求外，其余七项指标均应有所要求。 第四节、生物样品分析方法的基本要求 1、被测定的药物和代谢物的浓度低； 2、样品大多需要分离和净化； 3、样品量少，连续测定时，很难再度获得完全相同 的样品。 4、工作量较大， 5、要求很快地提供结果(毒物检测) 一、样品的种类、采集和贮藏 （一）血样：血浆、血清 血浆：选用最多。因血浆中的药浓可反映药物在 体内的状况。而且血浆中药物浓度的数据报道较 多，可供借鉴。 血浆是全血在加肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂 的全血经离心后分取，量约为全血的一半。 血清则是在血液中纤维蛋白元等影响下，自然凝 结引起析出血块，离心取得。 （二）、唾液：唾液中的药物浓度通常与血 浆浓度相关。样品易得，取样无损害，尤 易为儿童接收。有些可从药物唾液浓度推 定血浆中游离药物浓度。 （三）尿样： 尿样测定主要用于药物剂量回收研究、药物肾清 除率和生物利用度等研究，以及测定代谢物类型 等。体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可 以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物形式排 出。尿样常需加入防腐剂。 贮藏 血浆和血清需采集后及时分离，一般最迟不超过2h，分离 后再置冰箱或冷冻柜中保存。 尿样应立即测定，若收集24h的尿液不能立即测定时，可 加入甲苯、氯仿、醋酸等防腐剂，一般可保存2436h，也 可加入叠氮化钠可较长时间保存。 唾液在保存过程中会放出二氧化碳使pH值升高。另唾液中 含有粘蛋白，须离心后冷藏或冷冻 二、生物样品的预处理技术 样品的制备 要考虑：药物的理化性质、药物测定的目的、选 用的生物体液和组织的类型、待测物的浓度范围、 样品制备与分析技术的关系。 待测药物的理化性质 药物的pKa值、亲脂性、溶解度等——预处理及检测方法 具有亲脂性——在适当的pH值下用溶剂萃取 具有强极性或亲水性——沉淀蛋白、固相萃取、离子对HPLC法 药物的稳定性——萃取浓缩技术 对酸碱不稳定——酯、酰胺、两性药物避免使用强酸或强碱性溶剂， 流动相pH 对热不稳定——避免高温蒸发溶剂 具有挥发性——GC测定法 具有光谱或电化学特性——HPLC分析检测方法 待测药物的体内存在状态 体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物分析检测技术 浓度较低（尤其有代谢产物共存） ——代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定 ——采用色谱法、LC-MS、EIA等分析检测技术 分析测定的目的与要求 药代动力学——研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程 ——血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物 要求 ——同时测定原形药物和代谢产物 检测 ——宽线性范围(Cmax～Cmax的1/20)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属 性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离) 方法 ——大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、 LC-MS 分析测定的目的与要求 临床治疗药物监测 有效治疗浓度范围内药物浓度 方法——尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定 ——大多采用UV、RIA或EIA等 中毒患者的临床抢救 药物浓度可能很高 方法——强调方法的特异性和分析速度 —— 大 多 采 用 色 谱 及 其 联 用 技 术 GC 、 GC-MS 、 RIA 、 EIA 、 HPLC或HPLC-MS。 生物样品的类型与预处理方法 生物样品的类型与预处理方法 以血浆或血清为分析样品 采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术 ——分析样品较为“干净”，可用HPLC检测 用RIA分析 ——样品的预处理方法可较为粗放 ——经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定 实验室条件 在设计体内药物分析方法时，还应充分考 虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用 的仪器装备，合理选择可行的分析方法。 （一）、蛋白质的去除 是测定血浆、血清、全血及组织匀浆等样品中药 物时的最先处理步骤。 1、加入可与水混合的有机溶剂： 破坏蛋白质分子内及分子间的氢键。常加入乙腈、 甲醇、乙醇等，能使与蛋白结合状态的药物释放， 将混合物超速离心，取上清液作为样品。 2、加入中性盐 使蛋白脱水而沉淀，硫酸铵最常用 3、加入强酸 与蛋白形成沉淀，阴离子型沉淀剂。如三氯醋酸、 高氯酸、偏磷酸等，在酸性下分解的药物不宜用 本法去蛋白。 4、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 与蛋白形成沉淀，阳离子型沉淀剂 （二）、辍合物的水解： 酸水解法：强酸、加热 酶解：蛋白水解酶中的枯草菌溶素使组织酶解， 并使药物析出。优点：可避免药物在酸中水解及 较高温度时降解； 水解可显著改善对蛋白结合强的药物的回收率； 可用有机溶剂直接提取消化液而无乳化生成。 （三）有机破坏 当测定生物样品中的金属离子时，通常使用硝酸高氯酸作为消解剂，破坏后所得的金属离子为高 价态。又如凯氏定氮法等。 （四）分离、纯化与浓集 当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不 够高时，生物样品需分离、纯化与浓集。 1、液-液萃取 溶液的pH调节：最佳pH选择主要与药物的pKa值有关。体内 酸性物质较多，在碱性条件下不会被有机溶剂萃取出来， 而且多数药物碱性，故在pH值偏高的情况下进行提取较 好。 提取溶剂：选好提取溶剂可减少以后的净化操作，在液-液 提取中尽量采用极性小的溶剂。 提取：进行一次（至多二次）提取， 浓集：常用吹氮气使溶剂挥散，或减压蒸发（注意暴沸）。 酸碱度的选择 酸性药毒物：pH应低于药毒物pKa值1~2个单位 碱性药毒物：pH应高于药毒物pKa值1~2个单位 可保证90%以上药毒物解离 注意酯、酰胺、亚酰胺、苷类药毒物易分解 离子对提取法： 提取极性大的药物。一些酸性或碱性有机药 物在体液中呈离解状态，变成亲水性强的带电荷 离子，即使控制pH值也不能抑制其电离，使其不 能用有机溶剂从体液中提取出来。 对于呈离解状态的药物，当添加与药物离子 呈相反电荷的反离子，即可成为具有一定脂溶性 的离子对，用有机溶剂将其从水相中提取分离。 测定碱性药物时，一般用烷基磺酸盐类 （RSO3H）作为反离子，如庚烷磺酸钠、 辛烷磺酸钠等；测定酸性药物时一般用烷 基季铵类化合物作为反离子，如氢氧化四 丁基铵、四乙基铵盐等。 液液萃取 优点：可将大部分内源性杂质去除；经济实用、 可使样品富集、可一次进行多个样品萃取 缺点：乳化、污染环境、 乳化的去除：加少量固体氯化钠到水相中可减 轻乳化；轻微乳化离心；严重乳化低温冰箱快速 冷冻破坏乳化层后融化离心。 2、液-固萃取法： 以固相分离方法进行样品预处理，从水相中分离 出所需测定的组份，通常以柱分离方式进行操作， 故有时这种方法又称为固相提取 活化上样淋洗洗脱 洗脱液浓集 实验步骤 第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料 第二步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱 —除去大部分甲醇 第三步：加样，使样品经过小柱，弃去废液 第四步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱，去除内源性杂质 第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液， 挥干溶剂，备用或直接进行在线分析 血浆样品可直接上柱，样品量0.1~2ml，流速1~2ml/min 在线生物样品制备-柱切换高效液相色谱法 柱切换高效液相色谱技术是指由阀来改变流动相走向与 流动相系统，从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱进 入分析柱的技术。 用两个或两个以上柱子连接构成色谱网络系统，使不 同柱子达到不同分离目标，柱子间用切换阀联结，这就是 柱切换技术。 基本原理是首先在预柱上实现生物体液中干扰大分子与待测药 物的分离，然后用柱切换将待测药物从预柱转移至分析柱 上完成色谱分析。 （五）、化学衍生化 1、使药物变成能被分析的性质 2、提高检测灵敏度 3、增强药物稳定性 4、提高对光学异构体分离的能力 气相色谱衍生化 液相色谱衍生化 衍生化方法 硅烷化、酰化、烷基化—气相色谱衍生化方法 紫外衍生化、荧光衍生化、电化学衍生化、手性 衍生化—液相色谱衍生化方法 柱前衍生 柱后衍生 三、生物样品定量分析方法验证 1、特异性：空白、空白加样、用药后的谱图 2、标准曲线和线性范围：介质相同、包含所有浓度点 3、精密度与准确度：高中低三个浓度 4、定量下限：一般最高浓度的1/10-1/20 5、样品稳定性：冰冻、冻融稳定性、复溶溶液稳定性 6、提取回收率：高、中、低浓度 7、质控样品：随行标准 8、质量控制：生物样品测定 分离条件的筛选 在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物 质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下： 1．空白溶剂试验 ——溶剂(方法特异性) 2．空白生物基质试验 —— 内源性物质干扰(方法特异性) 3．模拟生物样品试验 —— 方法验证（效能指标） 4．实际生物样品测试 —— 代谢产物(方法特异性) （一）、方法特异性(专属性或选择性) 方法的特异性(specificity) ——又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用 ——系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力 专属性——表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的 选择性——系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区 分(分离)的能力 考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几 点：1. 内源性物质的干扰比较——待测药物或其活性 代谢产物检测信号；2. 代谢产物的干扰比较——模拟 生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号；3. 伍 用药物的干扰还要考虑患者可能同时服用药物(通常为 数有限)的干扰。提供三张色谱图，空白生物样品图、 空白加对照、实际生物样品图 （二）、标准曲线与线性范围 标准曲线（standard curve） ——生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性 ——除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线 性模式 ——回归分析法为最小二乘法或加权最小二乘法 线性范围——标准曲线的最高与最低浓度的区间 ——模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度 和准确度 标准曲线要求 标准曲线——用模拟生物样品（与待测的含药生物样 品相同的生物基质）建立 ——线性范围(不包括零点)应能覆盖全部生物样品 的药物浓度 ——不能使用外推的方法求算未知生物样品中的 药物浓度 —— 要求最低浓度点的偏差在±20%以内、其余 各浓度点的偏差在±15%以内。 （三）、准确度 方法准确度 ——系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度 与其真实浓度的接近程度 ——应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓 度是未知的，所以通常使用模拟生物样品测定 ——一般用相对回收率表示 测定： 取高(接近上限)、中、低（定量下限的3倍以内）3个浓 度，每一浓度至少5个样本，与随行的标准曲线同法测定、 计算方法回收率 限度要求： ——相对回收率应在85%～115% (LOQ附近80%～120%) ——RE在±15% (LOQ附近为±20%) （四）、精密度 方法精密度(precision ) ——系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度 ——表示该分析方法的可重复性 ——反映分析方法的可操作性，是方法验证的基本要点 实际生物样品的量有限(如血浆，一般为0.5～2ml) ——使用模拟生物样品测定 测定法 照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆)数份， 分别在同一批内和不同批间制备高、中、低 3个浓度的 QC样品，并分析测定 批内RSD ——每一浓度5个样品，每个样品测定1次，用随行标 准曲线分别计算3个浓度及RSD 批间RSD ——每1分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测 定1次；在不同天连续制备并测定3 个合格的分析批，至 少45 个样品。 限度要求 在药代动力学和生物利用度研究中 对g/ml级水平的RSD一般应≤10% ng/ml级水平的RSD一般应≤15% 在LOQ 附近RSD应≤20%。 （五）、定量下限 ——系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要 求)的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度，又 称为方法灵敏度 ——标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点≥LOQ) 要求——应能满足测定3～5个消除半衰期后生物样品中 的药物浓度；准确度在80%～120%；RSD＜20% （六）、稳定性 稳定性——包括方法稳定性和样品稳定性 方法稳定性——方法的耐用性 样品稳定性——生物样品的存放条件和时间、 冻-融循环(3次）、复溶溶剂中的稳定性 （七）、萃取回收率 萃取回收率与相对回收率的意义不同 萃取回收率——考察生物样品预处理 过程造成的药物的损失程度 取空白生物基质(如血浆)，照准确度项下方法，制备高、 中、低3个浓度的 QC样品(每一浓度至少5个样品)，每个样 品分析测定1次 另取等量的相同3个浓度的标准溶液，用溶解模拟生物 样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定 AT R 100 （%） AS AT——经萃取后的QC样品的检测信号或比值(内标法) AS——未经萃取的标准溶液的检测信号或比值(内标法) 限度要求 萃取回收率一般应≥60% 高、中浓度的RSD应≤15% 低浓度的RSD应≤20%。 八、质控样品 用空白生物介质加入待测药物对照品配制已 知浓度样品，考察方法稳定性 九、质量控制 方法考察完毕后作实际生物样品的测定，每 天建立标准曲线用于计算当天测定药物浓度。