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Compter les Microorganismes
Méthodes
•
•
•
•
Mesure de turbidité
Comptes viables
Nombre le plus probable
Comptes directs
Nombre le Plus probable: NPP
– Fondé sur les statistiques de probabilités
– Test présomptif fondé sur des caractéristiques
données
– Technique en bouillon
Nombre le Plus Probable (NPP)
• Commencer avec un bouillon qui permet de
déceler les caractéristiques désirées
• Inoculer differentes dilutions de l’échantillon à
être testé dans chacun de 3 tubes
-1
Dilution
-2 -3 -4 -5 -6
3 Tubes/Dilution
1 ml de chaque dilution dans chaque tube
Après une période d’incubation approprié, enregistrer les TUBES
POSITIFS (qui ont de la croissance et les caractéristiques désirées)
NPP- Suite
• L’objectif est de DILUÉ l’organisme à zero
• Après l’incubation, le nombre de tubes qui démontre les
caractéristiques désirées sont enregistré
– Exemple de résultats pour une suspension de 1g/10 ml de terre
• Dilutions:
-1 -2 -3 -4
• Tubes positifs: 3 2 1 0
– Choisir la bonne suite: 321 et la retrouver dans le tableau
– Multiplier le résultat par le facteur de dilution central
» 150 X 102 = 1.5 X 104/mL
» Puisque vous avez 1g dans 10mL doit multiplier encore par 10
» 1.5 X 105/g
Comptes Directes
• L’échantillon à être énuméré est appliqué sur
une lame d’hémacytomètre qui retient un
volume fixe dans une chambre de comptage
• Le nombre de cellules est compté
• Le nombre de cellules dans le volume donné
est déterminé
Déterminer le Compte Direct
• Compter le nombre de cellules dans trois carrés
indépendants
– 8, 8 et 5
• Déterminer la moyenne
– (8 + 8 + 5)/3 =7
– Donc 7 cellules/carré
7
Déterminer le Compte Direct (suite)
1mm
Profondeur: 0.1mm
1mm
• Calculer le volume d’un carré:
= 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X 10-4cm3 ou ml
• Diviser le nombre moyen de cellules par le volume
d’un carré
– Donc 7/ 1 X 10-4 ml = 7 X 104 cellules/ml
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Problème
• Un échantillon de 500μl est appliqué à une
lame d’hémacytomètre avec les dimensions
suivantes: 0.1mm X 0.1mm X 0.02mm. Des
comptes de 6, 4 et 2 cellules ont été faits dans
trois carrés indépendants. Quelle était le
nombre de cellules par millilitre dans
l’échantillon original si la chambre de
comptage possède 100 carrés?
Microscopie
Colorations Différentielles
Coloration de Gram
• Divise les bactéries en deux groupes
• Gram Négatives &
Gram Positives
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• Colorées Mauves
– Bacille
• Genres: Bacillus et Clostridium
– Coccus
• Genres: Streptococcus, Staphylococcus et Micrococcus
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• Colorées Rouges
– Bacille:
• Genres: Escherichia, Salmonella, Proteus, etc.
– Coccus:
• Genres: Neisseria, Moraxella et Acinetobacter
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Règles
• Si le nom est bacillus et/ou clostridium
= Gram (+), bacille
• Si le nom finisse par coccus ou cocci (autre
que les 3 exceptions, qui eux sont Gram (-))
= forme de coccus et Gram (+)
• Si ça fait pas partie des règles ci-dessus,
= Gram (-) bacilles
Paroi Cellulaire
Gram +
Vs
Gram -
Paroi
Peptidoglycane
Membrane
Plasmique
Absente
Couche de
Lipopolysaccharide
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Méthode - Coloration Primaire
1. Coloration avec le cristal violet +
2. Ajout d’iode de Gram (Mordant)
+ + +
Paroi :peptidoglycane
Membrane plasmique
+
+ + +
+ + +
+
+ + +
LPS
--------------Gram positif
--------------Gram Négatif
Méthode - Étape Différentielle
3. Lavage à alcool
Paroi est déshydratée
– Complex colorant + iode est piégé
Paroi :peptidoglycane
Membrane plasmique
Paroi n’est pas déshydratée
– Complex n’est pas piégé
LPS
- -+ - -+ - +- - +- - +- - +- -+- Gram positif
- -+ - -+ - +- - +- - +- - +- - +- Gram Négatif
Méthode - Contre Coloration
4. Coloration avec la Safranine +
+ + + + + + +
Paroi :peptidoglycane
Membrane plasmique
+ + + + + + +
LPS
- -+ - -+ - +- - +- - +- - +- -+- Gram positif
--------------Gram Négatif
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Sommaire
Fixation
Coloration primaire
Violet de cristal
Lavage
Décoloration
Contre coloration
Safranine
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Coloration Acido-Alcoolo-Résistante
• Coloration diagnostique de Mycobactérium
– Pathogènes de la Tuberculose et de la Lèpre
– Paroi cellulaire avec acide mycoïque
– Cireuse, très imperméable
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Méthode
• Principe:
– Contenu élevé de composés similaires aux cires
dans la paroi cellulaire, Acide Mycoïque, rend ces
bactéries très résistantes aux colorants
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Méthode (Suite)
• La paroi est rendue perméable par la chaleur
• Coloration avec de la fuchsine basique
– À base de phénol, soluble dans la couche
mycoique
– Refroidissement retourne la paroi à son état
imperméable
• Colorant est piégé
• Lavage avec de l’alcool acide
– Étape différentielle
• Mycobactéries retiennent le colorant
• Autres bactéries perdent le colorant
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Coloration de Spores
• Spores:
– Cellule bactérienne différentiée
– Résistante à la chaleur, la déshydratation, les
ultraviolets, et différents traitements chimiques
– Alors, très résistante aux colorant aussi!
– Typique des bacilles Gram positifs
• Genres Bacillus et Clostridium
– Conditions défavorables induisent la sporogénèse
• Différenciation de cellule végétative à l’endospore
– E.g. Anthrax
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Coloration au Vert
de
Malachite
Spores
Sporangium
(strucutre dans laquelle les
spores se forment)
(structures résistantes utilisées pour la
survie dans des conditions
défavorables)
Cellules végétatives
(en croissance active)
•
•
•
•
Endospore
(dormant, non reproductrices)
Perméabilisation des spores par la chaleur
Coloration primaire au vert de malachite
Lavage
Contre coloration à la safranine
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Les Pathogènes
19e Siècle- Robert Koch
• Étudie la maladie de l’anthrax qui tue les
vaches
• Fait croître la bactérie à partir du sang
d’animaux malades en culture pure
– Bacillus anthracis
• Observations:
– Le sang d’animaux malades transmet la maladie
– Le microorganisme se retrouve seulement chez les
animaux malades
– Le microorganisme crû en laboratoire transmet la
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maladie aux animaux sains
Robert Koch (suite)
• Conclusion: Les microorganismes sont
responsables des maladies
– Les pathogènes
• Ces résultats mènent Robert Koch à élaborer
des lignes directrices pour l’association d’un
microorganisme à une maladie
– Les postulats de Koch
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Postulats de Koch
• Le microorganisme doit être présent dans chaque
cas de maladie, mais absent des organismes sains
• Le microorganisme suspect doit être isolé et
cultivé en culture pure
• La maladie doit se développer quand le
microorganisme isolé est inoculé dans un hôte
sain
• Le même microorganisme doit être isolé à
nouveau de l’hôte malade
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