Transcript Validácia a správna laboratórna prax

VALIDÁCIA a
SPRÁVNA LABORATÓRNA PRAX
PharmDr. Lucia Veizerová, PhD.
ANALYTICKÁ METÓDA
princíp, rovnica merania
 pracovný postup
 požiadavky na materiály, prístroje, zariadenia
 pracovné charakteristiky (validácia)
 spôsob kvantifikácie (kalibrácia a výpočet)

VALIDÁCIA (POTVRDENIE PLATNOSTI)
Experimentálne potvrdenie, že metóda (merací
prístroj alebo výpočtová technika) zodpovedajú
určenému použitiu.


Plánovaný a dokumentovaný postup, ktorý predstavuje celý
rad činností, napr. určenie pracovného rozsahu metódy,
linearity, medze stanovenia, citlivosti metódy atď., vrátane
odhadu neistoty systému či metódy = zisťovanie
pracovných charakteristík metódy
Kto validuje?
a) Inštitúcie vydávajúce normy (SNAS)
b) Laboratóriá
Prečo validovať???
• výsledky analytických meraní majú silný dopad v
praxi. V klinickom laboratóriu môžu rozhodným
niekedy i fatálnym spôsobom ovplyvniť zdravie, kvalitu
života a niekedy i samotný život pacienta. Vo
forenznom laboratóriu vedú výsledky k opatreniam pre
vyšetrovaného jedinca atď...
• profesionálna povinnosť pracovníkov laboratória
uskutočňovať analýzy s dostatočnou kvalitou
• validácia poskytuje potrebné údaje o neistote
(intervale spoľahlivosti) výsledkov merania
• používanie riadne validovaných meraní vyžadované
pre akreditáciu laboratória (úradné potvrdenie
kompetencie laboratória)
Kedy validovať???
• zavedenie novej metódy
• nový analytický merací systém v laboratóriu
• ak sa rozšíri použitie danej metódy na ďalší účel
(ďalší druh biologického materiálu)
• ak pretrváva problém pri kontrole kvality
• prevzatie metódy (typ in house) z iného
laboratória, z publikácie
• po uplynutí určitého dohodnutého času
(revalidácia napr. 1 rok)
Požiadavky na validáciu analytickej metódy
Metodická smernica na akreditáciu:
VALIDÁCIA SKÚŠOBNÝCH METÓD
Všeobecné zásady a požiadavky
SNAS (Slovenská národná akreditačná služba)
• validácia uskutočnená na kvalifikovanom prístroji
• validačný plán – čo sa má validovať
• validačný protokol – ciele a postupy validácie
• validačná správa – výsledky validácie
• kompletná dokumentácia záznamová, hrubé dáta
• schválenie validácie a uvoľnenie metódy k používaniu
Protokol o
validácii
skúšobnej
metódy
Parametre validácie analytickej metódy
• presnosť (opakovateľnosť, reprodukovateľnosť)
• správnosť, pravdivosť
• selektivita, špecificita
• linearita, rozsah
• limit detekcie
• limit kvantifikácie
• robustnosť
Selektivita
• schopnosť meracieho systému alebo metódy dokázať či stanoviť
príslušný analyt resp. jednotlivé analyty aj v zložitej zmesi bez toho,
aby iné zložky ovplyvňovali výsledok analýzy. Výsledky ovplyvňuje
zloženie matrice. Týka sa mnohozložkovej analýzy
• mierou selektivity je kvantitatívne stanovený vplyv matrice
• určí sa prostredníctvom pokusov a porovnaním výsledkov analýzy
získaných s čistým analytom a za prítomnosti všetkých
predpokladaných reálnych rušivých zložiek v množstvách
odpovedajúcich reálnej matrici
Špecificita
• metóda zbavená vplyvu matrice. Vlastnosť metódy vzťahovať sa
výlučne na daný analyt. Jednozložková analýza.
Linearita (Linearity)
• schopnosť analytickej metódy poskytnúť odozvu, ktorá lineárne závisí od
koncentrácie analytu
• lineárny dynamický rozsah: rozsah hodnôt koncentrácie / množstva
analytu, v ktorom platí lineárna závislosť odozvy detektora v rámci povolenej
chyby konštantnosti citlivosti detektora
• vyjadruje sa:
 graficky: krivka závislosti odozvy od množstva stanovovanej látky
 matematicky: pomocou výsledkov lineárnej regresnej analýzy, vyjadrená
korelačným koeficientom R2
Rozsah (Range)
• interval koncentrácií, ktoré možno s definovanou presnosťou (s
definovanou neistotou) zisťovať danou metódou
• odvodený z linearity
Medza detekcie (Detection limit LOD)
• je najmenšia koncentrácia (množstvo) analytu, ktorej (ktorého)
prítomnosť vo vzorke ešte možno danou metódou spoľahlivo dokázať
(spoľahlivo odlíšiť od medze blanku)
• koncentrácia alebo množstvo, kedy je signál štatisticky významne
odlišný od šumu
• viacero spôsobov pre výpočet LOD
S
LOD  3 
N
S: výška píku sledovaného analytu (signál)
N: rozdiel najvyššieho a najnižšieho bodu na línii
pozadia v okolí analytu (šum)
Medza stanovenia (Quantification limit LOQ)
• najnižšia koncentrácia (množstvo) látky, ktoré (ktoré) možno stanoviť s
prijateľnou presnosťou a správnosťou (RSD = 15%)
• býva zhodný s dolnou hranicou lineárneho rozsahu kalibrácie
• viacero spôsobov pre výpočet LOQ
LOQ  10 
S
N
S: výška píku sledovaného analytu (signál)
N: rozdiel najvyššieho a najnižšieho bodu na línii
pozadia v okolí analytu (šum)
Presnosť (Precision)
• vyjadruje vzájomnú tesnosť v súbore výsledkov získaných
opakovaním meraní s použitím toho istého podielu vzorky za
špecifických podmienok
• závisí len od distribúcie náhodných chýb a nemá vzťah ku
skutočnej hodnote (metóda presná ale nesprávna)
• je mierou rozptýlenia nameraných hodnôt (podobné hodnoty =
vysoká presnosť)
• matematicky resp. kvantitatívne je vyjadrená hodnotou
smerodajnej odchýlky SD resp. s (čím menšie sú hodnoty
smerodajnej odchýlky, tým je presnosť väčšia)
Presnosť (Precision)
Smerodajná odchýlka s : rozptýlenie jednotlivých hodnôt xi okolo
priemeru xp
n: počet meraní
xp: priemerná hodnota
xi : meraná veličina
Relatívna smerodajná odchýlka RSD : pomer smerodajnej odchýlky a
priemernej hodnoty vyjadrený v percentách
s
RSD(%)  100
xp
s: smerodajná odchýlka
xp: priemerná hodnota
Presnosť podľa podmienok opakovania meraní:
Opakovateľnosť, intra-run (repeatibility)
Meranie toho istého podielu vzorky, na tom istom prístroji, tým istým
pracovníkom, v tom istom laboratóriu v krátkych časových úsekoch
medzi meraniami
Informácie o náhodnej chybe
Vnútrolaboratórna reprodukovateľnosť (intermediate precision)
Reprodukovateľnosť získaná v tom istom laboratóriu za dohodnutých
podmienok (metóda, skúšaná látka, operatér, prostredie) počas dlhej
doby)
Reprodukovateľnosť, inter-run (reproducibility)
Meranie toho istého podielu vzorky rovnakou metódou rozličnými
pracovníkmi, na rozličných prístrojoch, v rozličných laboratóriách a aj po
dlhších časových úsekoch medzi meraniami
Informácie o náhodnej aj systematickej chybe (okrem chyby vzťahujúcej
sa na matricu a analytickú metódu)
Pravdivosť (Trueness)
• tesnosť zhody medzi priemernou hodnotou výsledkov a pravou
(skutočnou) hodnotou veličiny
• je v nepriamo úmernom vzťahu so systematickou chybou merania a nie
je vôbec spojená s náhodnou chybou merania
• dlhodobo sa používal výraz „Správnosť“ !!!!!!!!!!!!!
• vyjadrená ako odchýlka (vychýlenie, bias) od správnej hodnoty
(kvantifikácia systematickej chyby merania)
• vychýlenie (bias): rozdiel priemernej hodnoty výsledkov analýz a
referenčnej hodnoty alebo percentuálny podiel
bias(%)  xp  
bias(%) 
Xp: priemerný výsledok
µ: skutočná hodnota
xp  

100
Správnosť (Accuracy)
• tesnosť zhody medzi jednou nameranou hodnotou
veličiny/výsledkom merania a pravou (skutočnou) hodnotou veličiny
• kvalitatívny parameter
• kombinuje presnosť (precision) a pravdivosť (trueness)
• zahŕňa systematické aj náhodné chyby merania
 ak namerané výsledky vykazujú malú chybu (vysoká pravdivosť) tak
správnosť = presnosť
- ak je presnosť nízka bude výsledok nesprávny a líši sa od
konvenčnej hodnoty
- ak je presnosť vysoká budú všetky výsledky správne
 ak vykazuje metóda veľkú chybu (nízka pravdivosť) budú aj presné
výsledky nesprávne
Presnosť vs. Správnosť (Pravdivosť)
Výťažnosť (Recovery)
• podiel nameranej a skutočnej koncentrácie/množstva látky
• udáva mieru schopnosti metódy merania postihnúť meraným
signálom všetok analyt prítomný vo vzorke
• miera účinnosti metódy
c
R(%) 
100
cref
xps  xp
R(%) 
100
xadd
c: koncentrácia zistená validovanou metódou
cref: referenčná (skutočná) koncentrácia
Xps: priemerný výsledok naspikovaných vzoriek
Xp: priemerný výsledok nenaspikovaných vzoriek
Xadd: množstvo pridaného analytu
Robustnosť (Robustness)
• miera schopnosti metódy stanoviť správne a presné výsledky aj pri
malých zmenách pracovných podmienok, ku ktorým dochádza behom
rutinnej analýzy pri dodržovaní pracovného postupu
• miera vplyvu premenných podmienok:
- ľudský faktor
- rôzne prístroje
- šarže
- malé zmeny pH roztokov
- stabilita vzorky v roztoku
- výkyvy teploty
- vplyv výmeny chromatografickej kolóny atď...
Validované parametre pri rôznych typoch analýz
Parameter
Kvalitatívna
analýza
Kvantitatívna
analýza
Presnosť
nie
áno
Správnosť
áno
áno
Linearita
nie
áno
Selektivita
áno
áno
Medza detekcie
áno
nie
Medza stanovenia
nie
áno
Robustnosť
áno
áno
AdLa s.r.o. je
moderné
privátne
zdravotnícke
zariadenie
poskytujúce
komplexnú
laboratórnu dia
gnostiku v
odboroch:
klinická
imunológia a
alergológia,
klinická
biochémia,
klinická
hematológia,
klinická
mikrobiológia.
SPRÁVNA LABORATÓRNA PRAX (SLP)
Medzinárodne uznávaný súbor pravidiel tvoriacich systém práce
testovacích zariadení (laboratórií) pri uskutočňovaní neklinických
chemických štúdií za účelom testovania zdravotnej a
environmentálnej bezpečnosti chemických látok a chemických
prípravkov; tieto pravidlá sa týkajú podmienok, za ktorých sa tieto
štúdie plánujú, uskutočňujú, kontrolujú, zaznamenávajú, predkladajú
a archivujú.
• Neklinická štúdia: skúška alebo súbor skúšok, ktorými sa za určených
laboratórnych podmienok alebo v určenom prostredí testuje látka s cieľom
získať údaje o jej vlastnostiach alebo jej bezpečnosti (fyzikálno-chemické,
biologické testovacie systémy)
• zásady SLP zavedené, aby sa získali hodnoverné a reprodukovateľné
výsledky a údaje o zdravotnej a environmentálnej bezpečnosti produktu
SPRÁVNA LABORATÓRNA PRAX (SLP)

nie zásady dobrých mravov laboratórneho pracovníka !!!!!!!

nie zásady bezpečnosti práce v laboratóriu!!!!!!!

medzinárodne dohodnutý systém zabezpečenia a kontroly kvality
neklinických štúdií

zásady GLP sú platné vyše 30 rokov (v SR od 1981, kedy prvý
preklad Good Laboratory Practice – FDA (GLP-FDA) do slovenského
jazyka)

dôvodom na jej zavedenie boli podvody toxikologických laboratórií
farmaceutických firiem v 70 rokoch minulého storočia (falošné
tvrdenia o uskutočnení testov na bezpečnosť, nedostatočné dáta o
testoch)
SLP - LEGISLATÍVA
SLP regulovaná vládou a ústredným orgánom štátnej správy
• Zákon č. 67/2010 Z. z. o podmienkach uvedenia chemických látok a
chemických zmesí na trh a o zmene a doplnení niektorých zákonov
(chemický zákon)
• Nariadenie vlády č. 320/2010 Z. z., ktorým sa upravujú činnosti
testovacích pracovísk a činnosti inšpektorov vykonávajúcich inšpekcie,
audit a overovanie dodržiavania zásad správnej laboratórnej praxe
• Nariadenie vlády č. 92/2012 Z. z., ktorým sa mení a dopĺňa
nariadenie vlády Slovenskej republiky č. 320/2010 Z. z., ktorým sa
upravujú činnosti testovacích pracovísk a činnosti inšpektorov
vykonávajúcich inšpekcie, audit a overovanie dodržiavania zásad
správnej laboratórnej praxe
• Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o
registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemických látok
(REACH) a o zriadení Európskej chemickej agentúry
NÁRODNÝ PROGRAM DODRŽIAVANIA ZÁSAD
SLP
• zisťuje, či testovacie pracoviská zaviedli zásady SLP do praxe a či sú
schopné zabezpečiť, že výsledné údaje majú zodpovedajúcu kvalitu
• NP SLP vymedzuje pôsobnosť a rozsah programu, poskytuje
informáciu o mechanizme, prostredníctvom ktorého testovacie
pracovisko vstúpi do programu, o druhoch inšpekcií testovacích
pracovísk a auditov štúdií, opisuje rôzne druhy inšpekcií, ako aj ich
frekvenciu a vymedzuje právomoci inšpektorov
• zavedený v roku 2008
OBLASŤ UPLATNENIA SLP
• zásady správnej laboratórnej praxe sa vzťahujú na testovanie zdravotnej
a environmentálnej bezpečnosti chemikálií obsiahnutých v
- humánnych liekoch
- veterinárnych liekoch
- kozmetických prípravkoch
- prípravkoch na ochranu rastlín
- v potravinových a krmivových doplnkoch
- biocídnych výrobkoch
- priemyselných chemických látkach a prípravkoch
za účelom vydania povolenia uviesť na trh prípravky a lieky a na reguláciu
priemyselných chemických látok
• vývoj a testovanie liečiv, vývoj a testovanie pesticídov, vývoj a testovanie
toxických chemikálií, kontrola potravinárskych aditív, testovanie látok s
ohľadom na nebezpečenstvo explózie
OBLASŤ UPLATNENIA SLP
• SLP nie je určená pro testovacie zariadenia – laboratóriá,
vykonávajúce rutinné kontrolné analýzy, napr. analýzy pitných vod
alebo ovzdušia
• zásady SLP určené pre zariadenia, ktoré poskytujú údaje o
nebezpečných vlastnostiach chemických látok a chemických
prípravkov pre účely klasifikácie
VÝZNAM SLP
• aplikácia SLP pri štúdiách = kvalita a integrita získaných údajov o
bezpečnosti nových chemikálií = dôvera regulačných orgánov pri
registrácii
• medzinárodný rozmer: regulačné orgány iných krajín sa opierajú o
údaje bezpečnosti získané v zariadeniach s osvedčením SLP = predíde
sa duplicite testov a zbytočnému opakovanému používaniu pokusných
zvierat, skráti sa čas potrebný na registráciu, ušetria sa finančné
prostriedky
KONTROLA A ZABEZPEČENIE DODRŽIAVANIA ZÁSAD SLP
• monitorovanie zásad SLP: akreditujúca osoba
• dodržiavanie zásad SLP splnené: Osvedčenie o
súlade so Správnou laboratórnou praxou (vydáva
SNAS – Slovenská národná akreditačná služba),
musí ho mať každé testovacie zariadenie
uskutočňujúce neklinické štúdie za účelom testovania
bezpečnosti chemických látok)
PODMIENKY TESTOVACIEHO
DODRŽIAVANIE ZÁSAD SLP
ZARIADENIA PRE
• určení vedúci pracovníci a hlavní výskumníci, definovaná ich pracovná
náplň, hierarchia – vedúci zariadenia, vedúci štúdie, vedúci dielčích
skúšaní, technickí pracovníci
• kvalifikovaní zamestnanci s výcvikom, praxou a určenou pracovnou
náplňou
• priestory (vhodná veľkosť, konštrukcia, umiestnenie, oddelené
skladovanie, testovacie systémy, príjem vzoriek)
• vhodné materiálne a prístrojové vybavenie (technicky spôsobilé a
kalibrované) na uskutočnenie štúdie
• identifikácia testovaných a referenčných látok
• vypracovanie a dodržiavanie štandardných pracovných postupov,
validovaných metód
• plán neklinickej štúdie
• program zabezpečovania kvality a pracovníci zodpovední za jeho
uplatňovanie (vybraní pracovníci, nezúčastňujú sa štúdie, oboznámení s
postupmi, overujú plány, postupy, dodržiavanie zásad SLP = vnútorná
inšpekcia)
• účasť v medzilaboratórnom porovnávaní
• ukladanie platných aj neplatných pracovných postupov, primárnych
dokumentov, plánov, záverečných správ
typy vzoriek
typy skúšok
SLP
Separačné metódy
Využívajú sa na izolovanie (separáciu) dokazovanej alebo stanovovanej
zložky z analyzovanej zmesi a na odstránenie rušivých (interferujúcich )
komponent analyzovaného roztoku (získanie čistých zložiek)
Separácia (delenie): operácia, pri ktorej sa vzorka delí aspoň na dva
podiely odlišného zloženia
Rozdelenie:
1. rôzna distribúcia jednotlivých zložiek medzi 2 fázy
(chromatografia)
2. rôzna rýchlosť pohybu jednotlivých zložiek v tej istej fáze
(elektroforéza)
Chromatografické metódy
• kontinuálna separácia zložiek medzi 2 fázy
• jedna fáza je pohyblivá (plyn, kvapalina) a bez ohľadu na skupenstvo sa
označuje ako mobilná fáza
• druhá fáza je nepohyblivá (tuhá látka, kvapalina) a označuje sa ako
stacionárna fáza = sorbent
• chromatografický proces rôzne formy a modifikácie = ťažké zvoliť model
rozdelenia
• primárne rozdelenie:
 plynová chromatografia GC (Gas chromatography) – mobilná fáza plyn
 kvapalinová chromatografia LC (Liquid chromatography) – mobilná
fáza
kvapalina
Chromatografické metódy
Podľa separačného princípu:
 adsorpčná: rôzna schopnosť oddeľovaných zložiek adsorbovať sa na
povrchu stacionárnej fázy
 rozdeľovacia: rozdielna rozpustnosť zložiek v stacionárnej a mobilnej
fáze
 iónovo-výmenná: separácia na základe elektrostatických príťažlivých síl
k stacionárnej fáze (iónomenič)
 gélová: separácia podľa veľkosti molekúl na pórovitej stacionárnej fáze
(gél), pričom pohyb menších molekúl sa spomaľuje zachytávaním v póroch
gélu
Chromatografické metódy
Delenie podľa spôsobu uloženia stacionárnej fázy:
 kolónová (stĺpcová) chromatografia: stacionárna fáza v trubici
(kolóne)
 chromatografia na tenkej vrstve TLC (Thin Layer
Chromatography): plošné usporiadanie stacionárnej fázy na pevnom
podklade (sklo, fólia)
 papierová chromatografia PC (Paper chromatography): stacionárna
fáza súčasťou chrom. papiera
Princíp separácie
• zložky sa pohybujú chromatografickým systémom rôznymi rýchlosťami,
ktoré závisia od interakcie zložiek s mobilnou a stacionárnou fázou.
Zložka, ktorá interaguje so stacionárnou fázou najsilnejšie sa v nej bude
najdlhšie zdržiavať, a preto sa bude pohybovať pomalšie ako ostatné
zložky, ktoré sa prednostne zdržiavajú v mobilnej fáze
Záznam chromatografickej separácie
• chromatogram
• píky (vlny
znázorňujúce
poradie
separovaných
zložiek
opúšťajúcich
kolónu)
• tR: čas od
nástreku po
maximum
odozvy detektora
• tM: retenčný
čas analytu,
ktorý nie je v
kolóne
zadržiavaný
Identifikácia: porovnanie elučného času
neznámej zložky s elučným časom
štandardu za rovnakých chromatografických
podmienok
Stanovenie: meranie plochy píkov
Plynová chromatografia
• princíp: rovnovážna distribúcia zložiek medzi plynnú-mobilnú a
kvapalnú alebo tuhú – stacionárnu fázu
• prchavé, termostabilné látky (organické látky s teplotou varu do 400 °C)
• ak látka neprchavá = derivatizácia na prchavú
• podľa stacionárnej fázy: adsorpčnú a rozdeľovaciu GC
• mobilná fáza = plyn: transport zložiek kolónou, nezúčastňuje sa
separačného procesu!!!! (inertné plyny – hélium, dusík, vodík, argón)
Plynová chromatografia
• prístroj: plynový chromatograf
zdroj nosného plynu
meranie a regulácia prietoku nosného plynu,
nástreková komôrka
chromatografická kolóna (náplňová, kapilárna)
termostat (izotermická analýza, analýza s teplotným gradientom),
detektor
vyhodnocovacie zariadenie
• náplňové kolóny (SiO2, na ňom ukotvená kvapalná stacionárna fáza) 1-3 m
kapilárne kolóny (stena kapiláry, na nej ukotvená kv. stacionárna fáza) 15-60m
• detektory:
1. Tepelno vodivostný detektor (univerzálny, nedeštruktívny)
2. Plameňový ionizačný detektor (selektívny, deštruktívny, veľmi citlivý)
(uhľovodíky)
3. Detektor elektrónového záchytu (seelktívny, nedeštruktívny)
(halogénderiváty, nitroderiváty)
4. Hmotnostný spektrometer (univerzálny, deštruktívny)
Využitie GC
• separácia, identifikácia, stanovenie prchavých látok
• kontrola čistoty látok
• výskum, priemysel štúdium a analýza:
zložiek životného prostredia
ropných produkov
potravín
kozmetiky
klinická toxikologická analýza
• široké uplatnenie: ľahká uskutočniteľnosť, rýchlosť
stanovenia
Kvapalinová chromatografia
• použitie kvapaliny ako mobilnej fázy, aktívna úloha v separačnom procese
(na rozdiel od GC)
• princíp: distribúcia zložiek medzi kvapalnou mobilnou fázou a tuhou alebo
kvapalnou stacionárnou fázou
• kvapalinová rozdeľovacia chromatografia: stacionárna fáza ukotvená
kvapalina, rozdielna polarita ako mobilná fáza, nemiešateľná so stac. f.
• kvapalinová adsorpčná chromatografia: tuhá fáza adsorbent, analyt sa
naadsorbuje na povrch a vytlačí predtým naviazanú mobilnú fázu
• prístroj: čerpadlo, dávkovanie vzorky, kolóna, detektor, vyhodnocovacie
zariadenie
• náplňové kolóny
• detektory: fotometrický, fluorescenčný, refraktometrický, elektrochemické
(vodivostný, voltamperometrický), hmotnostný spektrometer
Využitie LC
• separácia, identifikácia, stanovenie látok v
zmesiach (liečivá, drogy, hormóny, pesticídy,
peptidy atď...)
• kontrola čistoty preparátov (chemická výroba,
potravinárstvo)
• čistenie (purifikácia) a mikropreparácia látok