Transcript lec2_2
מבנה שלישוני מבנה המתקבל כאשר אזורים שונים של מבנה שניוני בשרשרת הפוליפפטידית נארזים אחד מול השני לקבלת מבנים מקופלים מיגלובין-לאחר קיפולו ליצירת מבנה תלת-מימדי החלבון מסוגל לבצע את תפקידו דוגמאות של חלבונים מקופלים מאפייני החלבון המקופל חלבונים מסיסים במים: חומצות אמינו טעונות נמצאות בחוץ חומצות אמינו הידרופוביות נמצאות בפנים חלבונים שיושבים בממברנות: חומצות אמינו טעונות נמצאות בפנים חומצות אמינו הידרופוביות נמצאות בחוץ מהו הכוח העיקרי המניע את תהליך הקיפול? האפקט ההידרופובי ,נובע מתכונות המים כממס פולרי אדום-חומצות אמינו הידרופוביות ירוק –חומצות אמינו הידרופיליות ייצוב המבנה השלישוני באמצעות קשרים די-סולפתיים הנוצרים בין שתי מולקולות של חומצה אמינית צסטאין מבנה רבעוני מספר שרשראות פוליפפטידיות מסוגלות להתאגד ליצירת אוליגומר כל שרשרת היא תת-יחידה בפפטיד קשרים די-סולפידים תורמים לייצוב המבנה הרבעוני הררכיה בארכיטקטורה של חלבונים -סיכום מבנה ראשוני (רצף) :חומצות אמיניות קשורות בקשרים פפטידים מבנה שניוני :מיצב בעיקר על-ידי קשרי מימן מבנה שלישוני: מיצב על-ידי קשרים מימן ,אינטרקציות ואן-דר ואלס, אלקטרוסטטיות והידרופובות ,קשרים די-סולפידים מבנה רבעוני: מיצב על-ידי קשרי מימן ,אינטרקציות ואן-דר ואלס, אלקטרוסטטיות והידרופובות ,קשרים די-סולפידים דהנטורציה של חלבונים דנטורציה של חלבונים -שינוי במבנה שלישוני ורבעיוני של החלבונים ממבנה הנטיבי מתקבל מבנה אקראי .תהליך החזרה ממצב של מבנה אקראי (דנטורטיבי) למבנה נטיבי נקרא רה-נטורציה ראגנטים כמו Ureaו Guanidium chlorid-מחלישים את האפקט ההידרופובי ובכך גורמות לדנטורציה של החלבונים b-mercaptoethanolחומר הגורם לחיזור קשרים די-סולפידיים גורם לדנטורציה של חלבונים דנטורציה של חלבונים -סיכום טיפול האינטרקציות שנהרסות כולם pHקיצוני דטרגנטים קשרים יונים וקשרי מימן קשרים הידרופוביים אוריאה ,גואנידין כלוריד בטא-מרקפטו- אתנולDDT , קשרי מימן ,קשרים הידרופוביים קשרים די- סולפידיים חום הנסיונות של כריס אנפינסן ()1963 החוקר בודד במבחנה חלבון נקי (ריבונוקלאז) במבנה הנטיבי שלו. (חלבון זה מכיל קשרי .) S-Sחלבון היה בעל פעילות ביולוגית בעזרת 8 M Ureaו b-mercaptoethanol -החוקר גרם לדנטורציה של החלבון – החלבון הפך להיות בעל מבנה אקראי .בבדיקת הפעילות הביולוגית החלבון נמצא ללא פעילות .נעשת רה-נטורציה של החלבון על-ידי הוצאות הראגנטים (דיאליזה) ושוב נבדקה פעילות הביולוגית של החלבון ונמצא שאחרי הרנטורציה הפעילות הביולוגית של החלבון חזרה. מה המסכנה העולה מניסוי זה? חקר חלבונים -שיטות שיטות לניקוי חלבונים קביעת רצף של חומצות אמינו שיטות אימוניות לחקר חלבונים שיטות לקביעת מבנה תלת ממדי של החלבון תכונות החלבונים המשמשים כבסיס להפרדה: מסיסות גודל או משקל מולקולרי מטען זיקה ()affinity הפרדה על-פי מסיסות: מוסיפים לפרקציה תאית שממנה רוצים להפריד חלבון מסויים כמות מסויימת של ( ammonium sulfateמלח) מכניסים תערובת למבחנת צנטריפוגה ומקבלים 2פרקציות: משקע עם חלבונים פחות מסיסים ונוזל עליון עם חלבונים יותר מסיסים. הפרדה על-פי משקל מולקולרי: .1דיאליזה – מפרידה בין מקרומולקולות למולקולות קטנות :gel filtration .2הפרדה של מולקולות על-פי גודל (מבנה נטיבי של חלבון) .3אלקטרופורזה על גבי ג'ל בתנאים דנטורטיביים. הפרדה על-פי מטען: .1כרומוטוגרפיה באמצעות שרפים טעונים .2הפרדה בג'ל על-פי מטען )(isoelectric focusing הפרדה על פי מטען וגודל ג'ל דו מימדי הפרדה על-פי זיקה: קולונות זיקה )(Affinity chromatography ניקוי חלבון הפרדת ראשונית למרכיבי התא שבירת תאים צנטריפוגה ציטוזול שברי תאים מיטוכונדריות פרקציה של גרעיני התאים לוקחים פרקציה רצויה ומפרידים חלבון על-פי תכונותיו מעכב אחר ניקוי חלבון נעשה בעזרת מבחן פעילות )(assay – Salting outהפרדה ע"פ מסיסות במרבית החלבונים מסיסותם יורדת כאשר ריכוז המלחים עולה. לתופעה זו קוראים .salting out ריכוז המלחים בו חלבון מאבד את מסיסותו שונה בין חלבון לחלבון, לכן ניתן לחלק את תמיסת תערובת החלבונים למקטעים (פרקציות). לדוגמא לחלבון אלבומין (בסרום) יש צורך בריכוז של 2.4Mאמוניום סולפט ,ואילו לפיברינוגן (מעורב בקרישת הדם) מספיק ריכוז של .0.8M Salting outמשמש גם לריכוז חלבונים מתמיסות מהולות .לצורך הסרת המלחים ניתן להשתמש בדיאליזה. דיאליזה (– )Dialysis הפרדה ע"פ גודל ניתן להפריד חלבונים ממולקולות קטנות (כגון מלחים) ע"י דיאליזה, זאת באמצעות שימוש בממבראנה חדירה למחצה. מולקולות הגדולות באופן משמעותי מגודל הנקבוביות יישארו בתוך שקית הדיאליזה .מולקולות קטנות ויונים יכולים לעבור את הממבראנה עד להשוואת ריכוזים. בשלב זה ניתן להחליף את התמיסה החיצונית ולחזור על התהליך. ערבוב מסייע להגיע לשיווי משקל בזמן קצר יותר. Ion Exchange מחלף יונים המטען הכללי של החלבון תלוי ב pH-שבו הוא נמצא מחלף אנינים :משתמשים בשרף בעל מטענים חיוביים משתמשים בבופר בעל pHמעל ה pH-האיזואלקטרי של החלבון (מטען כללי של החלבון שלילי) החלבון נקשר לשרף ומשחררים אותו עם ריכוז עולה של תמיסת מלח. )DEAE cellulose (or sephadex מחלף קטיונים :ממשתמשים בשרף בעל מטענים שליליים משתמשים בבופר בעל pHמתחת ה pH-האיזואלקטרי של החלבון (מטען כללי של החלבון חיובי) החלבון נקשר לשרף ומשחררים אותו עם עם ריכוז עולה של תמיסת מלח. CM-cellulose or Sephadex. Gel filtration כרומוטוגרפיה על פי גודל משתמשים בשרף עם פורות ) (poresכאשר יש אפשרות לשלוט בגודל של הפורות .מולקולות קטנות מספיק מסוגלות להכנס אל הפורות ולצאת מתוכם. מולקולות גדולות יותר עוברות בין הפורות .לכן מולקולות גדולות יוצאת ראשונות מהקולונה ומולקולות קטנות יוצאות אחרונות. השרפים הם בדרך כלל dextrans, agarose ,polyacrylamide HPLC ()High Performance Liquid Chromatography הפרדה ע"פ גודל מכשיר להפרדת חלבונים קטנים ופפטידים המורכב מכדורים קטנים בעלי נקבוביות .זמן ההרצה בהתאם לגודל החלבון (קטנים יופיעו קודם). תמיסת החלבונים מוזרקת בלחץ גבוה. החלבונים נעים על גבי ממס נוזלי שמהווה את הפאזה הניידת. HPLCמורכב ממיכל הפאזה הניידת ,משאבה, –injectorבו מזריקים את הדוגמא ,קולונה להפרדה (המורכבת מכדורים קטנים בעלי נקבוביות) ,וגלאי (.)detector - כרומטוגרפית אפיניות ( - )Affinity chromatography הפרדה לפי זיקה /קישור שיטה זו משתמשת בתכונה שיש לחלבונים רבים לקשור בזיקה (אפיוניות) גבוהה לקבוצות כימיות שונות .לדוגמא ניתן להפיק חלבון המופק מצמחים Concanavalin Aע"י העברתו בקולונה עם שרף המכיל שיירי גלוקוז. חלבון זה יקשר באפיוניות רבה לגלוקוז ,ואילו שאר החלבונים לא יקשרו .לאחר מכן ניתן לשחרר את ה Concanavalin A -ע"י הוספת תמיסה מרוכזת של גלוקוז .הגלוקוז בתמיסה יחליף את שיירי הגלוקוז בשרף. Affinity Chromatography הפרדת חלבונים בשיטת אלקטרופורזה על-גבי הג'ל )(SDS-PAGE קביעת משקל המולקולרי של חלבון קיים יחס הפוך בין משקל מולקולרי של חלבון לבין המוביליות שלו בג'ל Marker 100 kDa 90 kDa 75 kDa 60 kDa 40 kDa 25 kDa 15 kDa הפרדה בשני כיוונים – על בסיס מטען חשמלי וגודל אלקטרופורזה דו-מימדית ()Two-Dimensional Electrophoresis חלבונים ניתן להפריד גם לפי המטען שלהם .לכל חלבון יש מידת pHשבה המטען הכללי של החלבון יתאפס .לנקודה זו קוראים נקודה איזואלקטרית (.)isoelectric point כאשר נכין ג'ל עם גרדיאנט של ,pHכל חלבון יעצור בנקודה שהמטען שלו יתאפס. לאחר מיכן ניתן להפריד ע"פ גודל ()SDS PAGE – כך נקבל הפרדה דו-מימדית בעלת רזולוציה מאוד גבוהה .כאשר ההפרדה האופקית היא לפי מטען ,וההפרדה האנכית היא לפי גודל. בדיקת יעילות ניקוי של חלבון ע"י חישוב פעילות ספציפית בכל שלב .לשם כך יש צורך לחשב את כמות החלבון הכללית בכל שלב. פעילות ספציפית – הפעילות הכללית של החלבון מחולקת בכמות החלבון. קביעת רצף של חומצות אמינו .1קביעת תכולת החומצות האמינו נעשית על ידי הידרוליזה חומצית ב – 24h 110oCוהפרדה של החומצות האמיניות השונות בעזרת HPLC כל חומצה אמינית יוצאת בזמן אחר מהקולונה .2קביעת החומצה המצויה בקצה האמיני שימוש בראגנט סנגר )Sanger reagent- FDNB (1-fluoro-2,4-dinitrobenzene זיהוי החומצה האמינית נעשה על ידי HPLC .3קביעת רצף של פפטיד קצר ,ראקצית אדמן Edman degradation - ראגנט אדמן נקשר לחומצה האמינית הראשונה (קצה אמיני) ולאחר הידרוליזה עדינה לא נפגע שאר השרשרת הפוליפפטידית וניתן לחזור על התהליך באופן זה ניתן לקבוע את הרצף בד"כ ניתן לקבוע את 50חומצות האמינו הראשונות מכלל רצף החלבון א .4חיתוך החלבון לשרשראות פולי-פפטידיות קצרות יותר פרוטאזות מזרזות הידרוליזה של קשרים פפטידים טריפסין מזרז חיתוך של קשר פפטידי אחרי חומצות אמיניות מסוג Lys or Arg כמוטריפסין מזרז חיתוך של קשר פפטידי אחרי חומצות אמיניות מסוג Tyr or Phe ראגנט כימי ציאנוגן ברומיד -מזרז הידרוליזה של הקשר הפפטידי אחרי חומצה אמינית Met דגמא לקביעת רצף של פוליפפטיד ( נעשה עיכול עם טריפסיןA) לקביעת רצף של פפטיד:שאלה : התקבלו התוצאות הבאות.וכימוטריפסין Trypsin 2 peptides (B,C) Chymotrypsin 1 peptide (D) + di-peptides Tryptic peptides (B) Ala-Ala-Ala-Trp-Gly-Lys (C) Thr-Phe-Val-Lys Chymotryptic peptide (D) Val-Lys-Ala-Ala-Ala-Trp ?)A( מהוא הרצף ההתחלתי של הפפטיד חוקר במעבדה בודד פפטיד שמורכב מ 8-חומצות אמיניות : .AVGWRVKS הוא פירק אותו עם אינזים טריפסין .איזה שיטה תעדיף/פי: מחלף יונים או כרומוטגרפיה על פי גודל על-מנת להפריד בין התוצרים. נמק/י את תשובתך.